铁氧还蛋白(Ferredoxin,Fd)广泛存在于各种植物、动物及微生物体内参与电子传递。高等植物基因组编码的Fd蛋白可分为光合型Fd,非光合型Fd;此外还有一类具有C末端延伸的Fd,被命名为FdC蛋白。在光合作用的光反应中,光合型Fd从PSI中接收电子,然后将这些电子传输到下游Fd依赖的各种代谢过程,涉及碳同化、氮同化、硫同化、叶绿素代谢、光敏色素合成、脂肪酸合成等诸多生物学途径,在调节光合电子向依赖于这些电子的代谢途径分配中起关键作用。水稻基因组编码5个Fd蛋白和2个FdC蛋白,但是这些蛋白参与水稻光合电子传递的分子机制以及对水稻生长发育的影响尚不清楚。深入研究水稻Fd参与光合电子传递的分子调控机制有助于加深对光合作用分子机理的理解,进而为最终通过合成生物学等方法,利用光合作用为人类提供更多清洁、可持续的能源及光合产物奠定理论基础。在之前的研究中我们发现FdC2在水稻抽穗期和生长发育中起着重要作用。本研究通过一系列的实验证明,水稻中有两个光合型Fd,Fd1和FdC2,其中Fd1是水稻光合电子传递的主要光合型Fd蛋白,Fd1受损会导致突变体光合碳同化受阻,三叶期后迅速黄化并致死。本文主要结论如下:1.利用同源比对我们发现水稻基因组共编码5个Fd蛋白和2个FdC蛋白。7个蛋白的聚类分析表明,只有Fd1可能为光合型Fd蛋白。RT-qPCR检测野生型叶片中7个Fd基因的表达量发现,Fd1表达量最高,与Fd1相比,除了FdC2表达量约为Fd1的15%外,其他Fd的表达都非常低,仅为Fd1表达量的0.1-2%,几乎可以忽略不计。此外,Fd1主要在光合组织中表达,根中几乎检测不到其表达量,这些结果说明水稻中有两个光合型Fd蛋白,其中Fd1是水稻中主要的光合型Fd。2.体外细胞色素c和NADP~+光还原实验证明,Fd1和FdC2蛋白均可从PSI接受电子,Fd1可将接受的电子传递给FNR生成NADPH,为水稻碳同化提供还原力。但是,FdC2不能将电子传递给FNR生成NADPH,说明FdC2并不直接参与水稻光合碳同化,而是承担着其他水稻生长发育所必须的生物学功能,其真正的电子受体尚不清楚。亚细胞定位和免疫定位分析结果表明Fd1定位于水稻叶绿体。这些结果表明,作为水稻中主要的两个光合型Fd蛋白,Fd1主要参与水稻光合碳同化,而FdC2则可能执行某种补充或分流的作用,调控水稻生长发育。3.利用CRISPR/Cas9技术我们构建了fd1突变体。使用Swiss-Model工具对野生型和选定的三个ΔFd1突变蛋白三维结构分析发现,不同的转基因株系中Fd1基因均发生了功能丧失型突变。RT-qPCR结果表明,突变体中Fd1表达量显著下降。fd1突变体在三叶期前与野生型类似,但进入三叶期后叶片迅速黄化并死亡,无法正常进入四叶期。内源糖和NADPH含量测定结果表明fd1突变体三叶期后,内源糖和NADPH积累量远低于野生型,外施糖可以部分延长突变体的生长,随着外施糖浓度的升高,突变体的生长时间也相应延长。fd1突变体中Calvin-Benson循环相关基因的表达水平和酶活性较野生型明显下降。这些结果均表明Fd1影响水稻内源碳同化及碳同化产物的积累,对水稻的正常生长发育是必须的。4.与野生型相比fd1突变体三叶期后叶绿素含量急速下降,叶绿体数目明显减少,并且叶绿体内没有可见的淀粉颗粒,而野生型中则积累了大量的光合产物——淀粉粒,这说明三叶期后野生型开始进行光合碳同化,将碳同化产物积累于叶绿体,为水稻生长提供能源,而突变体由于光合受损,无法产生足够的光合产物,造成突变体中光合色素的快速降解和叶片迅速黄化并随之致死。5.叶绿素荧光参数测定结果表明,fd1突变体中Fv/Fm和φII的值显著低于野生型,说明突变体PSII的活性受到了强烈的抑制,在非光化学猝灭系数NPQ无明显变化的基础上造成光化学猝灭系数qP的明显降低,说明突变体中用于进行光合的光量子数比野生型明显减少,而非光合的光量子数几乎不变,同时突变体中电子传递率也显著降低。这些结果说明Fd1突变后,突变体的光合效率确实发生了明显的降低。6.在fd1突变体中FdC2的表达水平有所降低,而hdy1(fdc2突变体)突变体中Fd1表达也是降低的。与之对应的是fd1和hdy1突变体中Fd依赖基因的转录水平变化趋势基本一致。这些结果表明作为水稻中两个主要的光合型Fd,Fd1和FdC2并不是互为补充的关系,而是存在某种协同性。Fd1和FdC2虽然都参与水稻光合电子传递,但它们所参与的生物学途径并不重叠,都是水稻生长发育所必须的电子传递蛋白。