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2013年3月,中国疾病预防与控制中心（CDC）首次公布三例新型H7N9型禽流感确诊病例,截止目前该病毒已造成数百人感染,死亡率极高[1]。禽流感病毒基因极易突变,因此需防范大范围流行事件。目前治疗禽流感的一线化学药物包括M2蛋白阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂,但现已证实H7N9型禽流感病毒对M2蛋白阻滞剂耐药,且有10%的病毒对神经氨酸酶抑制剂耐药[1-2]。近年来通过基因工程研发的新型抗体药物在禽流感防治中展现出良好的应用前景,随着技术的不断完善,全人源抗体技术的出现能很好地弥补早期基因工程抗体的不足[3]。血凝素（hemagglutinin,HA）介导禽流感病毒结合膜受体,并进而发生膜融合[4]。HA由球状HA1亚基和杆状HA2亚基通过二硫键连接,两者均存在多个抗体结合位点,HA2较HA1含有更多保守抗体结合位点[5]。靶向结合某些HA位点的中和抗体可有效阻断病毒感染机制并在体内诱发多种抗病毒免疫反应,在禽流感预防与治疗有着良好的应用前景[6]。本文从本实验室已构建的人源Fab噬菌体抗体库筛选抗血凝素特异性Fab抗体,再构建全分子表达载体,利用真核表达系统高效表达全分子抗H7N9血凝素IgG中和抗体。本研究可为H7N9型禽流感的防治提供备选抗体药物,也为新发禽流感的防治带来新的思路。方法:1.人源抗H7N9血凝素Fab噬菌体抗体库的筛选利用A/Shanghai2/2013（H7N9）型禽流感病毒血凝素蛋白对人源Fab噬菌体抗体库孵育依次进行六轮“吸附—洗脱—扩增”富集筛选,并随机挑取特异性噬菌体克隆。phage-ELISA鉴定阳性克隆送测序以获取相应克隆可变区序列。2.重组抗H7N9型禽流感病毒血凝素IgG抗体真核表达载体的构建及鉴定将抗H7N9型禽流感病毒血凝素Fab基因可变区序列与人类抗体基因组序列数据库（http://www.imgt.org/）进行比对,根据同源性修复核酸序列FR1起始处及FR4结尾处的基因突变,分别酶切抗体真核表达载体pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hκ,这两种质粒分别携带IgG1型人源重链和轻链（Kappa）恒定区基因序列。根据In-Fusion PCR原理设计抗体的重、轻链可变区PCR扩增引物,扩增重、轻链可变区序列,将PCR产物分别克隆到抗体重、轻链真核表达载体中。转化大肠杆菌DH5α后,筛选阳性克隆测序。3.人源抗H7N9型禽流感病毒血凝素IgG抗体的表达及纯化将测序正确的重组质粒转染到293F细胞中,培养6天后收集细胞培养上清过滤后使用AKTA蛋白纯化系统及Hitrap Protein A预装柱纯化抗体。纯化后使用30 kD超滤离心管置以PBS换抗体缓冲液,浓缩后的抗体使用0.22 μm滤膜过滤并分装保存。4.人源抗H7N9型禽流感病毒血凝素IgG抗体免疫学特性分析分别用ELISA、Western blot实验对人源抗H7N9型禽流感病毒血凝素IgG抗体的结合特异性进行检测。5.人源抗H7N9型禽流感病毒血凝素IgG抗体中和活性鉴定用Reed-Muench两氏法获得H7N9型禽流感病毒对MDCK细胞的TCID50值,据此进行微量中和实验以获得IgG抗体中和滴度。鸡胚预防保护实验鉴定其在鸡胚中对病毒的中和能力。血凝抑制实验验证抗体结合位点所在血凝素亚基。结果:1.人源抗H7N9血凝素Fab噬菌体抗体库的筛选通过 phage-ELISA 筛选出 5 株阳性 Fab 克隆 1A4、2F2、4C1、5B2、6A7,送测序并对序列进行比对、分析。选取一株Fab抗体6A7,确定其可变区为人免疫球蛋白可变区基因,包括351 bp的VH基因和339 bp的Vκ基因。2.重组抗H7N9型禽流感病毒血凝素IgG抗体真核表达载体的构建及鉴定经过序列比对及引物设计,VH基因和Vκ基因经In-Fusion PCR克隆到酶切后的pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hκ载体上并获得IgG抗体重、轻链真核表达质粒,转化大肠杆菌DH5α后测序正确。3.人源抗H7N9型禽流感病毒血凝素IgG抗体的表达及纯化使用293F真核表达系统成功表达人源抗H7N9血凝素特异性IgG抗体,表达抗体得率高,纯化后纯度好。SDS-PAGE结果显示,纯化后的抗体在55 kD和25 kD左右各有一条带,分别为人源抗H7N9血凝素IgG抗体的重、轻链。4.人源抗H7N9型禽流感病毒血凝素IgG抗体免疫学特性分析ELISA实验显示人源抗H7N9血凝素IgG抗体与灭活H7N9型禽流感病毒能特异性结合,并具有良好的量效关系,抗体浓度为0.039 μg/mL时仍可较好的识别病毒抗原表位。Western blot实验证实该抗体能特异性结合灭活H7N9型禽流感病毒血凝素蛋白。5.人源抗H7N9型禽流感病毒血凝素IgG抗体中和活性鉴定用Reed-Muench两氏法计算H7N9型禽流感病毒对MDCK细胞的半数细胞培养物感染量TCID50,微量中和实验检测该抗体中和滴度为15.6 μg/mL。鸡胚预防保护实验表明抗体对鸡胚的保护作用与抗体浓度呈正相关,当抗体的用量为200 μg时可达100%保护。血凝抑制实验提示抗体结合的表位位于血凝素HA2亚基。结论:1.利用全人源Fab噬菌体抗体库筛选得到一株H7N9血凝素特异性Fab抗体基因,成功构建全分子人源抗H7N9血凝素抗体真核表达载体,表达并纯化后的人源抗H7N9血凝素IgG抗体具有良好的生物学活性。2.初步证明本研究制备的人源抗H7N9血凝素IgG抗体对H7N9型禽流感病毒具有较好的中和活性,且结合的抗原表位位于禽流感血凝素蛋白HA2亚基,具有潜在广谱中和活性。