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极地地区独特的环境条件,使大部分生物无法正常生存,但极地同时也是一个微生物资源非常丰富的宝库。很多研究证明了极地地区微生物的多样性,其中大多数微生物属于嗜冷、耐冷微生物。但丰富的极地微生物资源并未得到很好的开发与利用,由于生长环境的特殊性,这些微生物在人工规模化培养方面遇到了诸多瓶颈,比如低温、高盐、高压等特殊培养环境。本课题研究对象Geomyces sp.WNF-15A是一株分离自南极的适冷丝状真菌,在低温下培养可以生产红色素,其对人无致病性,分离方法简单,色价高且稳定性好,具有成为食用色素工业菌株的潜力,已受到广泛的关注。但是该菌株是一株典型的适冷真菌,最适培养温度为10～15℃,且仅在低温条件下高产红色素。本研究针对Geomyces sp.WNF-15A建立完善的遗传操作体系,筛选和构建稳定有效的转座子系统,开发转座子插入突变方法,建立极地微生物常温突变菌株的高效筛选平台,筛选常温适应突变株,为更好地促进该菌株的产业化应用奠定基础,也为其他极地真菌产物资源开发提供一定的参考。首先,建立了适冷真菌Geomyces sp.WNF-15A的完整遗传操作体系。通过抗生素筛选确定了 2种有效的筛选标记,即孢子数小于1.1×105个条件下使用高于200μg/ml的遗传霉素G418,以及孢子数小于3.8×105个条件下高于30 μg/ml的潮霉素B。针对菌丝培养温度、培养基、培养时间、裂解酶组成、酶解温度、酶解时间及酶解液pH等多个参数,对原生质体制备过程进行了详细优化探究,最终确定了最适条件:20℃下,YPD培养基培养36h以收获菌丝体,用纤维素酶(3%)和蜗牛酶(1.5%)配制酶解液,pH调节为7.5,在28℃下,酶解菌丝体1.5～2 h,即可得到3×1010个/ml原生质体。进一步,探究了孵育时间、外源载体浓度及PEG浓度对原生质体转化的影响,发现2μg载体在60%PEG下进行转化,孵育36 h后加盖抗性培养基,可得到最优转化效率50%。同时,针对该菌孢子PCR的方法进行改进,有效提高了孢子PCR的效率。其次,选取了三种真菌转座子系统,即Impala、Fot1及Helitron转座系统。通过NCBI数据库比对了这些转座子同家族转座酶的部分氨基酸序列,找到相对保守的氨基酸片段,针对Geomyces sp.WNF-15A是否有内源相关转座酶进行了验证,以保证外源转座体系的可控性和稳定性。根据氨基酸比对结果,设计保守区域的简并引物,未扩增到同源度较高的序列,由此推断,该菌的内源转座酶不会对上述三种转座系统产生影响。在此基础上,以丝状真菌通用型质粒pFC332为出发质粒,改造构建了单元载体骨架pFC000,并进一步构建得到Impala转座子的单元载体pFC001、Fot1转座子的单元载体pFC002。同样,采用上述方法构建了Helitron转座系统的辅助质粒Helper,并以pFC-WF1为基础质粒构建了Helitron转座系统的供体质粒Donor,完成了Helitron转座子双元载体的构建。由此,成功构建了三种具有霉菌通用性元件的转座载体。最后,将转座载体转化进入Geomyces sp.WNF-15A,经过多轮转化、筛选及鉴定,筛选得到了 13株在产量方面有明显变化的突变株,以及16株在生长方面优势明显的突变株。其中,14℃下,突变株MP1达到了所有菌株的最高产量(OD520=39),相比野生株提高了 40%。20℃下,突变株MP14达到了该温度下的最高产量(OD520=14.8),达到野生株的近2倍。25℃下,突变株MP2的红色素产量为OD520=2.2,突变株MP10的红色素为OD520=3.2,而野生株在该温度下无明显的红色素合成。对三种转座系统的效率进行分析,发现三者的转化效率基本一致(～10%)。对比三种转座系统的插入效率,发现Helitron转座系统在极地真菌Geomyces sp.WNF-15A中的活性比Impala、Fot1更好,有效正向突变率也最高。