碱茅铵转运蛋白(PutAMT1;1)基因的克隆及功能研究

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:virtualboxscdl
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铵转运蛋白(ammonium transporters,简称AMT)基因在众多生物中被克隆与鉴定,它是一种广泛存在于微生物、植物细胞及动物的细胞膜上主动转运铵离子的载体,分子量约为48kDa,含有10-11个跨膜域.不同氮素条件下,铵转运蛋白基因通过转录调控表现了对铵离子吸收转运的不同特点,使植物根系在较宽的浓度范围中吸收铵离子,对作物能合理有效的吸收氮素,为农业生产粮食增收提供了有利保障。本研究从碱茅的cDNA文库中克隆得到了铵转运蛋白基因(PutAMT1;1)。对基因的表达特性、酵母亚细胞定位、酵母突变体中铵转运蛋白的功能进行了解析,结果如下:1.测序结果表明,PutAMT1;1基因cDNA全长为2129 bp,ORF区域为1500 bp,编码499个氨基酸残基,通过软件预测分析表明,PutAMT1;1基因分子量为55.47kDa,等电点为5.28,属于酸性膜蛋白,具有11个跨膜域。氨基酸序列同源比较的结果,PutAMT1;1与TaAMT1;1具有92%的同源性,系统进化树分析的结果表明PutAMT1;1归属于铵转运蛋白AMT1亚家族。2.PUtAMT1;1基因的表达特性分析的结果表明,PutAMT1;1基因在碱茅叶、根、茎、穗、穗茎、叶鞘、花药和花八个器官中都有不同程度的表达,其中,在叶和花中的表达微弱,在花药中表达最强。在不同NH4+浓度和不同时间处理下,PutAMT1;1基因在碱茅叶和根中的表达与处理条件均有一定的应答关系。3.将重组质粒pYES2-GFP-PutAMT1;1转入酵母细胞,PutAMT1;1与绿色荧光蛋白融合,同时以GFP为对照,用2%半乳糖诱导该基因表达,通过激光共聚焦显微镜观察的结果表明,在酵母细胞中GFP-PutAMT1融合蛋白明显存在于细胞膜上。4.将PutAMT1;1基因构建到酵母表达载体pYES2上,获得重组质粒pYES2-PutAMT1;1,将pYES2(对照)和pYES2-PutAMT1;1转入酵母突变体31019b中,通过酵母突变体吸收NH4+功能互补的实验表明,pYES2(对照)酵母与pYES2-PutAMT1;1酵母在含不同浓度NH4+培养基上生长趋势没有明显的差别,这个结果暗示了全长PutAMT1;1基因在酵母中表达也许没有发挥吸收转运铵离子的作用。
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