研究背景与目的:　　 人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)是人体内促生长因子家族成员之一,它不仅可以刺激角膜上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞增殖分化,而且还能有效促进组织损伤愈合。　　 以hEGF蛋白或重组体作为治疗药物对角膜损伤性疾病进行基因治疗是目前角膜损伤性疾病基础和临床前期试验的热点方向之一,尽管近年来众多的科研工作者以hEGF作为治疗基因对角膜损伤性疾病进行基因治疗做了大量研究,但以慢病毒作为携带hEGF基因进入机体的载体的研究还未进行,为了便于对慢病毒作为载体携带hEGF基因进行基因治疗,促进组织损伤修复的作用机理进行深入研究,本研究将hEGF基因序列插入含有绿色荧光蛋白(green fluorescentproteln,GFP)基因的慢病毒载体(psinGFP)内,完成hEGF慢病毒载体(pSinGFP-hEGF)的基因构建,并将构建的慢病毒载体在辅助包装病毒载体。VSV G和△8.2的共同作用下转染到293T细胞中进行表达,获得具有治疗作用但无毒副作用的假慢病毒颗粒,以适宜浓度进行对角膜损伤模型的治疗,并对治疗效果及基因表达进行观察,现报告如下。　　 实验方法:　　 1.hEGF慢病毒载体的构建:酶切并收集pcDNA3.1-hEGF载体中的hEGF目的基因片段,克隆进入含有荧光报告基因的慢病毒载体(pSinGFP)内。　　 2.慢病毒载体转染:所得重组体与辅助载体(VSVG,△8.2)一起转染293T细胞,进行病毒包装,收集上清液。检测病毒滴度,蛋白质表达水平用Western Blot分析。　　 3.包装后的慢病毒的基因治疗:制作角膜碱烧伤的模型动物,用上述制作的慢病毒颗粒以适宜浓度进行滴眼治疗,检测基因治疗的效果和hEGF基因表达水平。　　 结果：　　 1.hEGF慢病毒载体的构建:经MluⅠ、EcoRⅤ酶切pcDNA3.1-hEGF,并将hEGF基因定向克隆到慢病毒载体中。HindⅢ酶切鉴定在600bp处可见电泳条带,PCR鉴定产物在900bp处可见电泳条带,表明hEGF慢病毒载体构建成功。　　 2.慢病毒转染:将重组子与包装质粒△8.2及包膜质粒VSV G在脂质体介导下转染到293T细胞中。在荧光显微镜下检测发出绿色荧光；病毒滴度达到109TU/ml。Western Blot检测表明蛋白质能高效表达。　　 3.hEGF基因治疗:hEGF基因在转染后21d内,在转染组织中可检测到hEGFDNA。免疫组织化学检测最早在24h后可检测到hEGF基因表达。在2w以后,表达结果为阴性。　　 结论：　　 1.成功构建了含有绿色荧光报告基因的hEGF慢病毒载体。　　 2.完成hEGF慢病毒载体及辅助质粒对293T细胞的转染,获得高滴度的假慢病毒颗粒。　　 3.EGF基因治疗,能有效降低损伤角膜组织的炎症反应,并能促进角膜上皮增生和损伤角膜的修复。