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天冬氨酸激酶(Aspartate Kinase，AK)是催化合成天冬氨酸家族氨基酸途径中的首个关键别构酶，受到代谢产物Thr与Lys的协同反馈抑制，以致该合成途径中下游产物难以大量积累。本研究旨在利用定点饱和突变提高AK酶活力并解除反馈抑制。在获得北京棒杆菌单体天冬氨酸激酶(CpAK)并分析其结构的基础上，选取ATP周围的关键残基位点并对其进行定点饱和突变，利用高通量筛选技术选取酶活力提高的突变株，对野生型和突变体AK进行酶促动力学研究和酶学性质表征。研究结果如下：
1.突变位点筛选。通过同源序列比对和CpAK模型分析，选取Tyr198、Asp201、Val276和Thr278作为突变位点，对其进行定点饱和突变以获得酶活力提高的突变株。
2.突变株构建。对所选的突变位点进行定点饱和突变，利用高通量筛选获得7株单突变株，分别为Y198N、Y198D、D201M、D201R、V276L、V276A、T278K，在单突变体和实验室前期获得的三突变体基础上，构建双突变体Y198N/D201M、Y198N/D201R(简称MN、RN)、和四突变体T379N/A380C/G171I/Y198N、T379N/A380C/G171I/D201M(简称NCIN、NCIM)，经SDS-PAGE和Westernblot验证，各突变株均在大肠杆菌中成功表达。
3.酶促动力学分析。7株单突变株的酶活力均提高，相较于野生型AK(WT AK)分别提高15.25、11.11、13.55、12.81、6.46、3.29、7.06倍，只有V276AKm值增大，其他突变株Km值均减小，说明与底物亲和力增强。双突变株MN和RN的酶活力较野生型提高18.26和16.08倍，其中RNKm值增大。四突变株NCIN和NCIM酶活力与野生型相比分别提高75.64和68.50倍，Km值均减小，说明与底物亲和力增强，所有的突变体希尔系数n值均减小，正协同效应减弱，表明酶与底物结合后与抑制剂的亲和力减弱。
4.酶学性质分析。WTAK最适温度为25℃，最适pH为8，半衰期为4.6h，单突变株Y198N、Y198D、D201M、D201R、V276L、V276A、T278K的最适温度分别为26℃、28℃、25℃、26℃、26℃、25℃、28℃，其中Y198D和T278K的最适温度较野生型提高3℃。T278K的最适pH为7.5，有利于菌株发酵生产，Y198D的最适pH为8.5，其余突变株最适pH均为8，与野生型相同。半衰期分别为4.6h、3.8h、4.1h、3.2h、4.3h、5h、5.5h，V276L和T278K的半衰期与野生型相比显著延长。双突变株MN、RN和四突变株NCIN、NCIM最适温度为28℃、26℃、25℃、26℃，MN耐高温性能增强，MN和NCIM最适pH为7.5，酶耐受pH范围变广，半衰期分别为5.3h、5.9h、3.9h和4.2h，其中MN和RN的半衰期分别延长0.7和1.3h。除V276A外，所有突变株在不同浓度抑制剂存在条件下酶活力有不同程度的提高，抑制作用减弱，甚至在不同浓度抑制剂存在时表现出激活作用。特别是四突变体在不同浓度Lys存在条件下，抑制作用完全被解除，10mmol/LLys+Thr+Met条件下，四突变体NCIN的酶活力可达140.62mmol/L，NCIM的酶活力达142.20mmol/L。
5.突变位点空间结构分析。198位点突变为Asn198和Asp198后与ATP之间的氢键数量增加，201位点突变为Met201和Arg201后与ATP之间的作用力增强，同时二者的距离缩短，276位点突变为Ala276和Leu276后蛋白的静电势增大，278位点突变为Lys278后侧链增长，与周围残基Leu412和Ala416的作用力增强稳定了ATP结合，有利于催化反应的进行，进而使酶活力提高。
1.突变位点筛选。通过同源序列比对和CpAK模型分析，选取Tyr198、Asp201、Val276和Thr278作为突变位点，对其进行定点饱和突变以获得酶活力提高的突变株。
2.突变株构建。对所选的突变位点进行定点饱和突变，利用高通量筛选获得7株单突变株，分别为Y198N、Y198D、D201M、D201R、V276L、V276A、T278K，在单突变体和实验室前期获得的三突变体基础上，构建双突变体Y198N/D201M、Y198N/D201R(简称MN、RN)、和四突变体T379N/A380C/G171I/Y198N、T379N/A380C/G171I/D201M(简称NCIN、NCIM)，经SDS-PAGE和Westernblot验证，各突变株均在大肠杆菌中成功表达。
3.酶促动力学分析。7株单突变株的酶活力均提高，相较于野生型AK(WT AK)分别提高15.25、11.11、13.55、12.81、6.46、3.29、7.06倍，只有V276AKm值增大，其他突变株Km值均减小，说明与底物亲和力增强。双突变株MN和RN的酶活力较野生型提高18.26和16.08倍，其中RNKm值增大。四突变株NCIN和NCIM酶活力与野生型相比分别提高75.64和68.50倍，Km值均减小，说明与底物亲和力增强，所有的突变体希尔系数n值均减小，正协同效应减弱，表明酶与底物结合后与抑制剂的亲和力减弱。
4.酶学性质分析。WTAK最适温度为25℃，最适pH为8，半衰期为4.6h，单突变株Y198N、Y198D、D201M、D201R、V276L、V276A、T278K的最适温度分别为26℃、28℃、25℃、26℃、26℃、25℃、28℃，其中Y198D和T278K的最适温度较野生型提高3℃。T278K的最适pH为7.5，有利于菌株发酵生产，Y198D的最适pH为8.5，其余突变株最适pH均为8，与野生型相同。半衰期分别为4.6h、3.8h、4.1h、3.2h、4.3h、5h、5.5h，V276L和T278K的半衰期与野生型相比显著延长。双突变株MN、RN和四突变株NCIN、NCIM最适温度为28℃、26℃、25℃、26℃，MN耐高温性能增强，MN和NCIM最适pH为7.5，酶耐受pH范围变广，半衰期分别为5.3h、5.9h、3.9h和4.2h，其中MN和RN的半衰期分别延长0.7和1.3h。除V276A外，所有突变株在不同浓度抑制剂存在条件下酶活力有不同程度的提高，抑制作用减弱，甚至在不同浓度抑制剂存在时表现出激活作用。特别是四突变体在不同浓度Lys存在条件下，抑制作用完全被解除，10mmol/LLys+Thr+Met条件下，四突变体NCIN的酶活力可达140.62mmol/L，NCIM的酶活力达142.20mmol/L。
5.突变位点空间结构分析。198位点突变为Asn198和Asp198后与ATP之间的氢键数量增加，201位点突变为Met201和Arg201后与ATP之间的作用力增强，同时二者的距离缩短，276位点突变为Ala276和Leu276后蛋白的静电势增大，278位点突变为Lys278后侧链增长，与周围残基Leu412和Ala416的作用力增强稳定了ATP结合，有利于催化反应的进行，进而使酶活力提高。