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脑缺血再灌注损伤(CIRI)是指脑缺血一段时间后恢复血液,这将引发一系列病理反应并引起更严重的继发性损伤,再灌注后细胞和组织中的生物分子被破坏。缺血再灌注(I/R)损伤的发病机制是多因素的和复杂的,涉及炎症、钙超载、氧化/亚硝化应激、内质网应激和表观遗传变化等。小胶质细胞是神经中枢中主要的免疫细胞,对防御病原微生物的入侵具有重要的作用,它是中枢神经系统最重要的免疫防线。炎症反应会导致小胶质细胞会经历不同形式的极化激活,主要包括M1和M2的极化。一些研究表明,促进小胶质细胞从M1转化为M2可能是CIRI的潜在治疗策略。小胶质细胞/巨噬细胞极化动力学揭示了局灶性脑缺血后损伤扩展的新机制。长链非编码RNA(Lnc RNA)是指长度超过200个核苷酸的非编码RNA(nc RNA),Lnc RNA不仅可以通过多种调控机制影响正常的生物学过程,还参与了各种疾病的进展。Lnc RNA母本印迹表达基因3(lnc RNA-MEG3)已被证明参与多种疾病过程,例如lnc RNA-MEG3在多种癌症和骨关节炎的诊断和预后中的潜在应用,lnc RNA-MEG3通过p53信号通路抑制胃癌的增殖和转移。此外,lnc RNA-MEG3通过可以通过调节炎症因子的表达来调节巨噬细胞的炎症反应。通过调节lnc RNA-MEG3/mi R-204/CDKN2A信号通路,lnc RNA-MEG3沉默可抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞炎症和细胞凋亡。但是,关于lnc RNA-MEG3是否通过调节小胶质细胞极化影响CIRI的报道很少。炎症反应是CIRI的重要病理生理机制,参与其发生和发展。炎症细胞主要包括白细胞、小胶质细胞及星形胶质细胞。其中,小胶质细胞存在于中枢神经系统(CNS)中,它是神经系统中重要的免疫细胞,主要负责脑内稳态。CIRI过程中许多反应都与小胶质细胞和先天免疫系统细胞的活动有关。因此,对CIRI过程中小胶质细胞活动的进一步研究将有助于保护I/R损伤后的任何脑损伤。另外,Krüppel样因子4(KLF4)可作用于多种信号通路,从而起到抗炎或者促炎作用,但是在不同的炎症反应时期中,KLF4往往发挥不同的作用。KLF4在不同细胞及组织中的作用机制也有差异,进一步深入研究KLF4在CIRI中的作用,对于探讨CIRI的发病机制有重要意义,且能够为治疗CIRI提供新的治疗靶点。在本研究中,我们将对lnc RNA-MEG3在CIRI中的作用展开研究,同时,通过体内实验和体外实验进一步明确lnc RNA-MEG3调控小胶质细胞炎症因子分泌的具体分子机制。材料与方法(1)利用大脑中动脉闭塞(MCAO)诱导构建脑缺血再灌注损伤(CIRI)小鼠模型。根据小鼠体重通过腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠。将直径为0.23 mm的4-0外科手术尼龙线插入颈内动脉以闭塞右侧大脑中动脉(MCA)。MCA阻塞60 min后,通过移除缝合线恢复血流(再灌注)。对于假手术组(n=8),除MCAO外,均进行相同的麻醉和手术程序。通过分别在1 d(n=8)、3 d(n=6)、5 d(n=6)、7 d(n=6)和14 d(n=6)时间点进行再灌注处死小鼠。其中,对2只假手术组的小鼠和2只再灌注1 d的小鼠进行TTC染色测量小鼠的脑梗死面积,每组取3只小鼠进行免疫荧光染色检测CD86或CD206与Iba1的共定位情况,并对3只小鼠进行Western blot和实时定量PCR(q RT-PCR)分别检测M1标记诱导型一氧化氮合酶(i NOS)水平和M2标记精氨酸酶1(Arg1)的水平。转染分组:将24只小鼠分为四组,分别为Sham、MCAO、MCAO+si-NC和MCAO+si-MEG3(n=6)。其中,MCAO组小鼠:用MCAO处理1 h,然后第7 d进行再灌注;MCAO+si-NC或MCAO+si-MEG3组:在MCAO之前进行转染,将si-NC或si-MEG3(100μmol/L)和Lipofectamine RNA i MAX转染试剂进行混合后转染,然后置于室温下孵育20 min,并在MCAO之前注入小鼠右脑室。通过改良神经功能缺损评分(m NSS)测试评估小鼠的神经系统状况。实时荧光定量PCR检测lnc RNA-MEG3的水平。Western blot检测KLF4、i NOS、和Arg1的表达水平。使用ELISA法检测细胞上清液中炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、IL-10和IL-4的水平。(2)糖氧剥夺/复氧(OGD/R)处理:将小鼠小胶质细胞系BV2细胞的培养基替换为无葡萄糖的DMEM培养基,并在95%N2和5%CO2的无氧培养箱中于37oC下孵育2 h,以模拟OGD/R损伤。然后,将BV2细胞的培养基替换为正常培养基,并放置在潮湿的培养箱中(95%空气和5%CO2)于37oC下进行培养。在不同时间(12 h、24 h、48 h)收集细胞。未经处理的正常培养的BV2细胞作为对照。转染分组:control、OGD/R、OGD/R+si-NC和OGD/R+si-MEG3。将BV2细胞分别转染si-NC和si-MEG3,并通过OGD处理2 h,然后再灌注48 h。使用实时荧光定量PCR检测MEG3的表达。使用Western blot分别检测CD86、i NOS、CD206、Arg1的表达水平。使用ELISA检测细胞上清液中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10的水平。MEG3和KLF4的过表达质粒转染或共转染到OGD/R处理的BV2细胞中,使用Western blot检测包括KLF4、CD86、i NOS、CD206、Arg1的表达水平。细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-4的水平通过ELISA法检测。(3)使用RNA pull-down实验和RNA免疫沉淀(RIP)实验验证BV2细胞中lnc RNA-MEG3与KLF4的结合。将lnc RNA-MEG3进行过表达,构建质粒pc DNA-MEG3或将si-MEG3转染到BV2细胞中,然后使用Western blot检测两组BV2细胞中KLF4水平。结果(1)与Sham组相比较,MCAO组的脑组织出现了白色梗塞区域。对小鼠进行MCAO处理1 h,然后在不同时间进行再灌注。与Sham组相比,MCAO/R组小鼠具有严重的神经功能障碍,但随着再灌注时间的增加而逐渐减少(P<0.01),表明小鼠CIRI模型的成功构建。此外,与Sham组相比,缺血后MCAO/R小鼠的大脑皮质梗死区域中lnc RNA-MEG3的水平显著增加并持续增加至少7 d(P<0.05),直至第14 d。MCAO/R小鼠在脑皮质梗死区域中显示出明显更高的M1标记i NOS水平,并且在缺血后7天持续升高(P<0.05)。相反地,再灌注后3 d,M2标记Arg1的水平继续增加,随后逐渐下降(P<0.05)。Lnc RNA-MEG3表达敲低后,MCAO处理小鼠的m NSS得分降低。敲低lnc RNA-MEG3后,MCAO处理的小鼠中M1标记i NOS水平显著降低,而KLF4和M2标记Arg1水平升高。与对照组相比,lnc RNA-MEG3敲低后Iba1和CD86的共定位降低,而Iba1和CD206的共定位升高。此外,在敲低lnc RNA-MEG3后,MCAO组小鼠脑组织中促炎因子TNF-α和IL-1β的水平降低,而抗炎因子IL-10和IL-4的水平升高。(2)BV2细胞接受OGD/R处理2 h后,lnc RNA-MEG3水平至少持续48 h内随时间的增加而增加。在OGD/R处理的BV2细胞中,M1标记CD86和i NOS的水平明显升高,而M2标记CD206和Arg1的水平明显降低。然而,si-MEG3的转染逆转了这些结果。在OGD/R处理的BV2细胞中,促炎因子TNF-α和IL-1β的水平升高,抗炎因子IL-10和IL-4的水平降低,但是si-MEG3的转染逆转了这些结果。将lnc RNA-MEG3和KLF4的过表达质粒转染或共转染到OGD/R处理的BV2细胞中。结果表明,lnc RNA-MEG3过表达显著提高了CD86、i NOS、TNF-α和IL-1β的水平,显著降低了CD206、Arg1、IL-10和IL-4的水平。相反地,KLF4的过表达显著降低了CD86、i NOS、TNF-α和IL-1β的水平,而CD206、Arg1、IL-10和IL-4的水平则显著增加。KLF4的过表达逆转了lnc RNA-MEG3过表达对pc DNA-MEG3转染的OGD/R处理的BV2细胞中M1和M2标志物和炎性因子的影响。(3)Lnc RNA-MEG3的pull-down沉淀物中富集KLF4,而KLF4蛋白免疫沉淀物中富含lnc RNA-MEG3,表明lnc RNA-MEG3能够与BV2细胞中的KLF4结合。在BV2细胞中转染pc DNA-MEG3后,lnc RNA-MEG3水平明显升高,KLF4蛋白水平明显降低。相反地,在转染si-MEG3后,lnc RNA-MEG3水平显著降低,而KLF4蛋白水平显著升高。这些结果证明lnc RNA-MEG3可以结合KLF4并抑制其表达。结论(1)Lnc RNA-MEG3在MCAO处理小鼠的脑组织中表达水平显著上调,同时,M1标记i NOS水平升高、M2标记Arg1的水平持续增加,但随后逐渐下降。在敲低lnc RNA-MEG3后,MCAO处理小鼠的脑组织中促炎因子TNF-α和IL-1β的水平降低,而抗炎因子IL-10和IL-4的水平升高。Iba1和CD86的共定位降低,而Iba1和CD206的共定位升高,表明lnc RNA-MEG3可能通过调控炎症反应参与小鼠小胶质细胞M1至M2极化的发展过程。(2)小胶质细胞BV2在经OGD/R处理后,lnc RNA-MEG3过表达显著提高了CD86、i NOS、TNF-α和IL-1β的水平,而显著降低了CD206、Arg1,IL-10和IL-4的水平。KLF4的过表达逆转了lnc RNA-MEG3过表达对pc DNA-MEG3转染的OGD/R处理的BV2细胞中M1和M2标志物和炎性因子的影响,表明KLF4参与lnc RNA-MEG3介导的OGD/R处理的小胶质细胞极化。(3)小鼠小胶质细胞中lnc RNA-MEG3能够与KLF4蛋白结合,并且lnc RNA-MEG3可以结合KLF4并抑制其表达。