研究背景与目的:脓毒症流行病学调查研究显示全球每年有1800万脓毒症患者,死亡率高达30%~50%,如并发感染性休克,患者的病死率可高达80%。因此,探索脓毒症发病机制,研究脓毒症的拮抗药物或治疗措施,对脓毒症患者的救治具有重要的意义。细菌、病毒、真菌及寄生虫等都可以引起脓毒症的发生,而革兰阴性菌仍是脓毒症发生的主要因素,侵入血中革兰阴性菌大量繁殖、死亡崩解释放的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),在胞外经一系列信号传递,最终通过TLR4将信号传递到胞内,引起炎症因子的释放,因而TLR4是LPS诱发脓毒症的枢纽,在脓毒症发生中发挥了重要作用,也成为脓毒症治疗药物研究的重要靶点。目前有关TLR4的抗体研究表明通过抑制TLR4能够抑制炎症因子的释放及降低动物的死亡率,然而,传统单克隆抗体存在组织穿透能力弱、生产成本及临床应用价格高昂等问题,在一定程度上限制了单克隆抗体的临床应用。基于骆驼重链抗体发现而开展的纳米抗体研究,为抗体药物进行疾病诊断、治疗提供新的途径。不同于传统四链抗体(包含两条重链和两条轻链),骆驼重链抗体在轻链缺失的情况下单独存在,同时骆驼重链抗体的可变区(Variable domain of the heavy chain,VHH)单个结构同样能够结合抗原,展示出良好的抗体活性,其结构呈椭圆形,直径2.5nm,高4nm,由于其大小在纳米物质规定的100nm内,因此将骆驼重链抗体VHH也称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。纳米抗体由于具有分子小,结构稳定、组织穿透能力强、可溶性高、易于制备、生产成本低等特点,展示了很好的应用前景。基于纳米抗体应用方面的优势及TLR4在介导脓毒症LPS信号传递过程中的重要作用,本研究拟通过TLR4胞外区抗原表达纯化、噬菌体抗体库展示技术,进行抗TLR4纳米抗体的制备,并通过体外细胞实验及体内LPS、细菌性脓毒症模型实验,探讨抗TLR4纳米抗对脓毒症大鼠的保护作用。研究方法:1.TLR4结构分析,选择TLR4胞外区,通过基因扩增、载体构建技术将TLR4的胞外区构建到原核表达载体p ET28a,通过纯化得到高纯度TLR4胞外区(ex-TLR4)。2.将纯化TLR4胞外区作为免疫原,于第0、14、28、42、56、70、84天,皮下多点抗原注射500μg/次,进行骆驼免疫,免疫后第7天采血进行抗体效价检测。采集高效价免疫骆驼外周血并分离淋巴细胞,扩增VHH,将VHH构建到p Cantab-5E噬菌体展示系统,电转入TG1宿主菌,并计算库容。3.ex-TLR4包被进行四轮淘洗,从第四轮淘洗后的纳米抗体库中随机挑取60个克隆,ex-TLR4包被,噬菌体ELISA筛选,将筛选到的阳性克隆,利用前期纯化的TLR4中间结构域(TI)、TLR4 C端结构域(TC)继续二次筛选,获得的阳性克隆,转化HB2151宿主菌,乳糖自动诱导进行纳米抗体的表达、纯化,获得纳米抗体分别命名为:TI-Nbs、TC-Nbs。4.体外通过LPS对NR8383细胞的刺激,加入制备的抗TI、TC结构域纳米抗体,ELISA观察纳米抗体对脂多糖诱导的细胞炎症因子(TNF-α、IL-6)释放的影响。5.体内分别通过LPS和革兰阴性菌细菌模型,观察抗TI、TC纳米抗体对动物存活率的影响。研究结果:1.选择TLR4胞外区序列,成功构建表达载体并获得高纯度的胞外区蛋白。2.ex-TLR4免疫骆驼,四次免疫后效价达到1:128000,采集外周血淋巴细胞,VHH构建到p Cantab-5E噬菌体展示系统建库,库容可达109。3.抗体库经四轮淘洗,第三轮富集倍数达到147倍,第四轮富集3.1倍,四轮淘选后抗体库达到富集,经ex-TLR4筛选获得16个阳性克隆,TI、TC二次筛选分别获得5个、7个阳性克隆,获得阳性克隆进一步自动诱导表达,表达产物以包涵体和可溶两种形式存在,可溶性表达产物纯化后纯度>90%。4.脂多糖诱导细胞炎症模型,获得针对TI的5个和TC的7个阳性克隆中,每组分别有3个和4个阳性克隆具有抑制细胞炎症因子释放的作用,抗TI纳米抗体抑制效果优于抗TC纳米抗体,两个纳米抗体的协同作用能进一步降低LPS诱导的炎症反应。5.选取细胞活性中和作用最强的纳米抗体进行动物实验,体内动物实验结果, LPS炎症模型组,抗TI、TC纳米抗体多次、联合给药的治疗效果优于单个纳米抗体、单次给药的治疗。细菌性脓毒症模型,进一步证实了两个纳米抗体多次、联合给药的方式,能够降低TNF-α、IL-6炎症因子的释放,并提高大鼠的存活率。结论:脓毒症的本质是机体对感染性因素引起的过度免疫反应,进而导致大量炎症因子释放和组织器官损伤,这一反应一旦触发即按照自身规律发展,并不不依赖感染因素,脓毒症的发生与否以及严重程度完全取决于机体的反应。病原体入侵机体时,依靠模式识别受体发挥防御作用,TLRs是天然免疫的主要“开关”。目前的研究表明,LPS可以诱导单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞TLR4基因表达上调,而上调的TLR4又作为新的受体介导更多的细胞活化和炎症介质的释放,在这种正反馈下,炎症反应不断放大,最终导致发展为脓毒症。本研究通过蛋白表达、纯化的方式获得TLR4胞外区抗原,噬菌体展示抗体库制备技术获得抗TLR4 C端和中间结构域的纳米抗体,体外、体内实验证实了抗TLR4纳米抗体能够有效降低炎症因子释放并提高动物的存活率,同时C端和中间域的同时封闭,效果更为明显,为脓毒症的临床治疗提供了新的思路和策略。