论文部分内容阅读
研究背景：感染是骨科临床实践中重点关注的问题之一,无论是假体相关性感染还是诸如开放性骨折、慢性骨髓炎等其它骨科感染,往往具有病原学复杂,抗生素耐药等问题,而对诸如“无菌性假体”松动这样的临床诊断中到底有无细菌的存在更是莫衷一是,争议颇多。临床传统应用的微生物纯培养方法对于这些问题的回答力有未逮。脱胎于坏境工程学科的分子生物学技术末端限制性片段长度多态性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP)通过对系统中微生物的标记DNA-16S rDNA—的检测,获取许多长度不同的末端限制性片段(Terminal Restriction Fragment, T-RF)或称分类操作单元(Operational Taxonomic Unit, OTU),从而可以全景式的解析系统中所有细菌群落的结构,这尤其对于检测那些临床传统方法不能培养的细菌意义重大。近年来T-RFLP方法正被逐渐应用于临床病原菌的检测,例如肠道菌群、阴道菌群等,但应用于骨科感染的研究尚未见报道。研究目的：1.应用T-RFLP技术分析怀疑感染的骨科标本中细菌群落分布情况；2.比较T-RFLP技术得到的结果与临床传统纯培养结果的异同；3.初步评价该技术的优缺点及其应用于临床的前景。研究方法：1.实验对象：骨科感染标本(包括假体相关性和非假体相关性),其它科感染标本；2.细菌检测方法：T-RFLP,临床纯培养；3.分析方法：i.对T-RFLP自身结果进行聚类分析；ii.对两者的比较则应用克隆文库测序、TAP (T-RFLP Analysis Program)和临床结果电子酶切的方法。研究结果：1.收集了59份临床样品,最终14份得到了T-RFLP谱图；2.聚类分析显示,样品可按照解剖部位分类,每类中末端限制性片段(T-RFs)的分布具有一般性规律：其中膝关节样品6、11、12、17中丰度最高的片段都是80bp、82bp、85bp,其总丰度超过40%；脊椎样品30、47中丰度最高的片段都是479bp,总丰度超过60%；3.对13号样品构建了克隆文库并测序,Blast分析(Basic Local Alignment Search Tool)序列结果为停乳链球菌,与临床培养结果一致；4.临床已知培养结果者电子酶切分析得到的T-RFs大多与T-RFLP实测情况相符(为丰度最多的片段,且两者相差在1-3bp)。结论：本研究应用末端限制性片段长度多态性技术对骨科感染标本中细菌群落结构的分布进行了全景式的扫描分析,并同临床传统纯培养方法进行了比较,发现：1.无论有无假体的存在,相同解剖部位的感染中细菌群落的分布都具有很高的相似性；2.部分临床诊断为“无菌性假体松动”的病例中可能也是有细菌感染存在的,且其菌群分布规律与相同解剖部位感染患者亦相似；3.通过对各种不同临床来源的样品处理以及与临床结果比对,证实了末端限制性片段长度多态性技术安全、稳定、可靠,具有广阔的临床应用前景；但为进一步提高临床样品的检出率,实验条件尚有待优化。