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目的:甲状腺癌（Thyroid Cancer,TC）是发生于甲状腺的恶性肿瘤,也是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,其中甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Carcinoma,PTC）起源于甲状腺实质的分化型甲状腺癌,是最常见的甲状腺恶性肿瘤,PTC的发生、发展是一个复杂的病理生理过程。课题组前期研究结果显示夏枯草提取物中熊果酸（Ursolic Acid,UA）可下调促癌基因PI3K、AKT、mTOR的表达,诱导人甲状腺乳头状癌细胞（TPC-1）凋亡。本实验将基于p53/MAPK信号通路探讨UA对TPC-1细胞增殖的抑制作用,为UA的临床应用及新药开发提供实验依据和参考。方法:1夏枯草提取物中UA对TPC-1细胞增殖的影响1.1夏枯草水、乙醇、乙酸乙酯提取物对TPC-1细胞增殖的影响将夏枯草果穗粉碎后分别加入纯净水、95%乙醇浸泡、煮沸、过滤、浓缩、灭菌,并取一部分乙醇浓缩液用乙酸乙酯萃取后浓缩、灭菌,得到夏枯草水、乙醇、乙酸乙酯提取物,将三种提取物浓度分别制备成75、37.5、18.75、9.375、4.6875、2.34375 mg/mL。采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT法）观察夏枯草三种提取物不同浓度作用TPC-1细胞48 h后的增殖情况,并计算相应的IC50值。1.2夏枯草乙酸乙酯提取物中UA、齐墩果酸（OA）、科罗索酸（CA）、山楂酸（MA）、白桦酯酸（BA）的含量测定采用C18-柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,流速:1.0 mL/min,柱温:25℃,紫外检测波长:210 nm,流动相:甲醇-乙腈-0.1%磷酸（80:5:15）的色谱条件进行含量测定。1.3夏枯草提取物中UA的提取及含量测定将夏枯草粉碎,用甲醇浸泡、超声、过滤、浓缩成浸膏,加水分散,加乙酸乙酯萃取,萃取三次,合并乙酸乙酯液,减压浓缩至膏体。取膏体用甲醇溶解,用HPLC-ELSD检测纯度,检测条件为流动相:甲醇:水=98:2,流速:1 mL/min,检测器:ELSD,色谱柱:C18（4.6 mm×250 mm,5μm）。将样品上样,用制备液相色谱分离纯化、收集、浓缩至粉末,得UA样品,制备液相色谱条件:色谱仪:varian SD1,色谱柱:C18（250 mm×50 mm,10 um）,流速:40 mL/min,流动相:甲醇:水=95:5。1.4夏枯草提取物中UA对TPC-1、人正常甲状腺上皮细胞（Nthy-ori3-1）细胞增殖的影响采用不同浓度UA分别干预TPC-1、Nthy-ori3-1细胞（对照组0μM,实验组1.5μM、3μM、6μM、12μM、24μM）,MTT法观察UA对TPC-1、Nthy-ori3-1细胞增殖的影响。2夏枯草提取物中UA作用PTC的RNA测序分析采用RNA-Seq测序技术对Nthy-ori3-1组、TPC-1细胞组、（UA 3μM+TPC-1、UA 6μM+TPC-1、UA 12μM+TPC-1）细胞组进行转录组分析,以照相对表达倍数（Fold Change）≥1.5,P值<0.05的标准筛选出差异表达的基因,然后对这些差异表达的基因进行GO、KEGG功能富集分析。采用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）验证富集通路p53/MAPK相关基因p53、Ras、MEK和ERK、TSHR、BRAF、DDR1、PAK4、PKACa、c-Myc、PIK3Ca mRNA的表达水平并进一步确定所选通路的准确性。3夏枯草提取物中UA对TPC-1的作用及机制研究3.1 UA诱导TPC-1细胞凋亡选取处于对数生长期的TPC-1细胞用于实验,用不同浓度的UA作用TPC-1细胞48h,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡的变化。3.2 UA对TPC-1细胞周期的影响选取处于对数生长期的TPC-1细胞用于实验,用不同浓度的UA作用TPC-1细胞48 h,流式细胞术（FCM）检测细胞周期中各时期细胞比例的变化。3.3夏枯草提取物中UA对TPC-1细胞p53/MAPK信号通路相关蛋白的影响选取处于对数生长期的TPC-1细胞用于实验,采用不同浓度UA干预细胞（阴性对照组、溶媒对照组、UA 3μM、UA 6μM、UA 12μM）,Western blot法检测经UA干预48 h后TPC-1细胞中TSHR、BRAF、PAK4、P-PAK4、PKACa、p53、c-Myc蛋白的表达情况。结果:1夏枯草提取物中UA对TPC-1细胞增殖的影响1.1夏枯草水、乙醇、乙酸乙酯提取物对TPC-1细胞增殖的影响夏枯草水、乙醇、乙酸乙酯提取物不同浓度作用TPC-1细胞后,得到的IC50值分别为:30.473、47.617、18.433 mg/mL,即夏枯草乙酸乙酯部分抑制TPC-1细胞增殖的作用较强。1.2夏枯草乙酸乙酯提取物中UA、OA、CA、MA、BA的含量测定夏枯草乙酸乙酯提取物中UA、OA、CA、MA、BA色谱峰与杂质峰分离效果良好,色谱峰没有出现拖尾的现象,UA峰面积最大。1.3夏枯草提取物中UA的提取及含量测定制备得到UA样品经HPLC-ELSD检测,纯度较纯,在线性范围内,UA含量随着超声时间的延长而增加,且在60 min时最高。1.4夏枯草提取物中UA对TPC-1、Nthy-ori3-1细胞增殖的影响MTT法测得UA作用TPC-1细胞后的IC50值为9.19±0.35μM,但对Nthy-ori3-1细胞增殖没有抑制作用,后续实验UA浓度低、中、高分别取3、6、12μM。2夏枯草提取物中UA作用PTC的RNA测序分析由差异表达基因富集的KEGG通路得出:与Nthy-ori3-1细胞组比较,TPC-1细胞组下调的通路有p53信号通路,上调的通路有MAPK信号通路等;与TPC-1细胞组比较,（UA 3μM+TPC-1、6μM+TPC-1、12μM+TPC-1）细胞组上调的通路有p53信号通路,下调的通路有MAPK信号通路等,富集程度随浓度的增大而增大。对p53信号通路和MAPK信号通路上的基因进行QRT-PCR验证,结果显示:与阴性对照组比较,UA 3、6、12μM给药组细胞内基因p53 mRNA表达水平上调（P<0.05）,Ras、MEK和ERK mRNA及相关基因TSHR、BRAF、DDR1、PAK4、PKACa、c-Myc、PIK3Ca mRNA表达水平下调（P<0.05）,将p53/MAPK信号通路作为后面的研究方向。3夏枯草提取物中UA对TPC-1的作用及机制研究3.1 UA诱导TPC-1细胞凋亡流式检测结果显示,UA作用TPC-1细胞48 h后,与阴性对照组相比,UA不同浓度组的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率差异均有统计学意义（P<0.05）,凋亡率随着浓度的增加而增加。3.2 UA对TPC-1细胞周期的影响不同浓度的UA作用TPC-1细胞48 h后,细胞周期各时期的细胞比例发生变化,与阴性对照组相比,随着UA浓度的提高S期细胞所占比例明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）。3.3夏枯草提取物中UA对TPC-1细胞p53/MAPK信号通路相关蛋白的影响Western blot结果显示,与阴性对照组相比,溶媒对照组p53、TSHR、BRAF、c-Myc、PKACa、PAK4、P-PAK4等蛋白差异无统计学意义（P>0.05）;不同浓度UA给药组细胞中p53、TSHR、BRAF、c-Myc、PKACa、PAK4、P-PAK4等蛋白均有表达,UA作用于TPC-1细胞48 h后,随着UA浓度的增加,p53蛋白的表达上调,差异有统计学意义（P<0.05）,TSHR、BRAF、PKACa、PAK4蛋白的表达均下调,差异有统计学意义（P<0.05）,c-Myc、P-PAK4蛋白的表达均下调,在UA浓度为6、12μM时,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:夏枯草提取物中UA抑制人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1增殖的作用,与促进细胞凋亡、阻滞细胞周期在S期、促进p53信号通路、抑制MAPK信号通路有关。