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大蒜是百合科葱属植物Allium Sativum L.的鳞茎,具有丰富的营养成分和药的用价值。其主要的功能性物质——大蒜素(二烯丙基硫代亚磺酸酯)及相关的次生有机硫化物,是由大蒜中的蒜氨酸酶(EC4.4.1.4)催化蒜氨酸类物质而形成。本试验用柱前衍生化分析测定了大蒜中蒜氨酸的含量,从大蒜中分别作了提取分离蒜氨酸和蒜氨酸酶的工艺研究,并将蒜氨酸酶固定在交联琼脂糖亲和载体上,以固化酶催化底物转化成大蒜素及其系列次生有机硫化物。主要试验结果如下:
(1)柱前衍生HPLC法检测鲜蒜中的蒜氨酸含量则为0.96%;以D113大孔弱酸树脂为载体从大蒜中分离得到大蒜混合氨基酸干燥粉末,其中蒜氨酸含量达到67.14%,提取率92.71%;
(2)用PEG沉淀法、离子交换层析法从大蒜中获得纯化的蒜氨酸酶,酶活力回收为47.38%,纯化倍数达到12倍;以天然提取的蒜氨酸为底物,蒜氨酸酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH为7.0,比活力为32.71U·mg-1,Km=3.521 mmol·L-1。SDS-PAGE结果显示,提纯的蒜氨酸酶达到了电泳纯;
(3)以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的交联琼脂糖为载体将蒜氨酸酶固定,研究了固定载体对蒜氨酸酶的固化工艺条件,及固化后蒜氨酸酶的酶学性质的变化,酶的氨基取代NHS与载体连接臂氨基已酸偶联,形成稳定的共价键;固定化后的蒜氨酸酶酶学性质,与固化前基本保持一致,最适反应温度为30~40℃,pH6.5;固化蒜氨酸酶的稳定性有所提高,35℃连续反应5天酶活基本不降低。
(4)研究了以乙酸乙酯、环己烷、无水乙醚等多种有机溶剂为媒介,分别从水相的反应产物溶液中萃取大蒜素,并获得大蒜素的次生转化产物;最佳提取条件为乙酸乙酯:水相体积比1:1,50℃萃取30min,大部分大蒜素转入有机相中,并转化为三种主要的产物。用200~300目硅胶对其进行分离,以正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等试剂洗脱,得到四个分离的组分,第二组分纯度最高,经核磁共振氢谱图谱显示,其化学结构为乙烯二噻烯。