糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的慢性并发症，已成为终末期肾衰竭的最主要原因之一。肾小管间质损伤同肾小球病变一样，是糖尿病肾病的主要特征及导致肾功能丧失的重要因素。DN的发病机制复杂，是糖代谢紊乱、肾小球血流动力学异常、生长因子、细胞因子以及遗传等多因素综合作用的结果，其中，炎症介质的产生及其诱导的单核巨噬细胞浸润是DN发病的重要机制之一。 骨调素(osteopontin，OPN)是肾间质巨噬细胞的主要趋化因子，具有多项功能，作为一种巨噬细胞趋化因子可以募集巨噬细胞，介导巨噬细胞等炎症细胞局部浸润，同时作为一种生长因子可以刺激细胞增殖和胶原合成。研究表明，多种肾脏疾病模型中肾小管OPN表达上调，与间质炎细胞浸润和随后的间质纤维化改变密切相关，其在糖尿病肾小管间质病变中也可能发挥重要作用。已有研究显示，HMG-CoA还原酶抑制剂对糖尿病大鼠及糖尿病患者均具有一定的肾脏保护作用，不仅与降低胆固醇水平有关，还存在非降脂的抗增殖、抗炎等作用，但其作用机制未完全阐明，是否与抑制肾脏OPN的表达有关，尚未见报道。 目的：本研究应用实验性糖尿病大鼠模型和高糖培养的人近端肾小管上皮细胞，从整体、细胞、分子等不同水平，系统观察糖尿病状态下肾小管间质OPN表达、巨噬细胞积聚、Ⅲ型胶原沉积等变化，及与糖尿病肾小管间质病变发生、发展的关系；另外应用HMG-CoA还原酶抑制剂氟伐他汀(fluvastatin)及OPN反义寡核苷酸对糖尿病大鼠模型和高糖培养的人近端肾小管上皮细胞进行干预，探讨其对糖尿病肾小管间质OPN表达的影响及其对肾脏的保护作用，为阐明糖尿病肾病的发病机理及寻找防治措施提供实验性理论依据。 1 糖尿病大鼠肾小管间质骨调素的表达变化 雄性SD大鼠48只，随机分为A组(正常对照组)和B组(糖尿病组)。用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱发实验性糖尿病模型。分别在成模后第2周、4周、6周收集标本，检测肾功能指标、肾脏组织形态学改变、肾小管间质OPN、ED-1、Ⅲ型胶原的表达。与同期A组相比，2、4、6周B组大鼠血糖、C反应蛋白、肾重/体重、尿NAG均有不同程度的升高。尿白蛋白排泄率6周时升高，与A组相比差异显著(P<0.01)。B组大鼠肾小球系膜基质增多，部分肾小管发生空泡变性，肾小球及肾小管基底膜增厚，间质增宽，炎性细胞浸润。免疫组化结果显示，2、4、6周B组大鼠肾小管上皮细胞OPN表达上调，肾间质ED-1阳性细胞数增多，均随病程延长而逐渐加重，6周时B组大鼠Ⅲ型胶原的表达上调(P<0.01)，并且各时间点OPN蛋白表达水平与ED-1阳性细胞呈明显的正相关(P<0.01)。RT-PCR半定量结果显示，各时间点B组大鼠肾脏OPN mRNA表达均较A组显著增高(2周P<0.05，4、6周P<0.01)。 2 高糖环境中人近端肾小管上皮细胞骨调素的表达变化 人近端肾小管上皮细胞HK2，分为三组：正常糖对照组(5.5mmol/LD-葡萄糖，NG)、高糖组(25mmol/LD-葡萄糖，HG)及高渗组(19.5 mmol/L甘露醇和5.5 mmol/LD-葡萄糖，MG)。分别于实验6h，24h，48h以及72h，运用半定量PT-PCR方法检测各组细胞OPN mRNA的表达；间接免疫荧光法，激光共聚焦显微镜下观察OPN蛋白的表达；ELISA法检测各组细胞培养上清中Ⅲ型胶原含量。RT-PCR及免疫荧光结果显示，HG组OPNmRNA表达在6h即出现升高，48h达高峰，并持续到72h(P<0.01)；HG组OPN’蛋白表达在6h、24h、48h、72h逐渐升高，同时各时间点与NG组相比，差异显著(P<0.01)。高渗组各时间点OPN mRNA及蛋白表达没有明显变化，与NG组相比差异无统计学意义(P>0.05)。EIASA结果显示HG组细胞培养上清液Ⅲ型胶原的含量在6h与NG组比较无明显差异(p>0.05)，24、48h时其含量较NG组增高，72h时增高更为明显(P<0.01)。高渗组细胞培养上清中Ⅲ型胶原含量没有明显变化，各时间点与NG组相比无统计学差异(P>0.05)。 3 反义寡核苷酸对高糖环境中人近端肾小管上皮细胞骨调素表达的影响 针对人OPN的cDNA.序列设计合成反义寡核苷酸(AS-ODN)，以正义寡核苷酸(S-ODN)及错义寡核苷酸(MS-ODN)为对照，所有碱基均经硫代修饰。细胞分为8组：①正常糖对照组；②高糖组；③高糖+AS-ODN/DOTAP(2μmol/L)；④高糖+S-ODN/DOTAP(2μmol/L)；⑤高糖+MS-ODN/DOTAP(2μmol/L)；⑥高糖+AS-ODN/DOTAP(20μmol/L)：⑦高糖+S-ODN/DOTAP(20μmol/L)；⑧高糖+MS-ODN/DOTAP(20μmol/L)。用脂质体介导法将不同浓度的OPN反义寡核苷酸转染人近端肾小管上皮细胞，荧光显微镜下观察各组细胞转染效率。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测OPNmRNA表达；间接免疫荧光法，激光共聚焦显微镜下观察OPN蛋白的表达；ELISA方法检测细胞培养上清中Ⅲ型胶原分泌情况。2μmol/L及20μmol/L浓度OPN AS.ODN组OPNmRNA、蛋白表达及上清中Ⅲ型胶原含量均明显低于高糖组(P<0.01)，并且20μmol/L组降低更明显。而相同浓度和时间的S-ODN组和MS-ODN组与高糖组无显著差异(P>0.05)。 4 氟伐他汀对糖尿病大鼠肾小管间质骨调素表达的影响 雄性SD大鼠随机分为A组(正常对照组)、B组(糖尿病组)和C组(氟伐他汀治疗组)。STZ诱导糖尿病模型。成模后，C组大鼠每日氟伐他汀按2mg·kg<-1>·d<-1>灌胃。在6周后收集标本，检测血糖、C反应蛋白、血脂、肾重／体重、尿白蛋白排泄率(UAER)，尿N-乙酰-B-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)；观察大鼠肾脏组织形态学改变；‘免疫组织化学方法检测肾小管间质OPN、ED-1、Ⅲ型胶原的表达；Western Blotting方法检测肾组织中OPN蛋白的表达；RT-PCR方法检测肾组织OPN mRNA表达。B组大鼠血糖、C反应蛋白、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、肾重/体重、UAER，尿NAG均高于A组(P<0.01)，C组血糖与B组相比无明显差异(P>0.05)，TG降低不明显，其余上述指标均较B组降低。光镜下B组大鼠肾小球系膜基质增多，肾小管空泡变性，肾小球及肾小管基底膜增厚，间质增宽，纤维组织增生，电镜下肾小球脏层上皮细胞足突融合，内皮细胞部分窗孔结构消失，肾小管上皮细胞线粒体肿胀甚至空泡化，肾小管基底膜增厚。C组肾脏病理改变较B组均明显减轻。免疫组化结果显示，B组大鼠肾小管间质OPN、 ED-1、Ⅲ型胶原的表达均上调，与A组比较，差异显著(P<0.01)，C组大鼠OPN、ED-1和Ⅲ型胶原的表达受到抑制(P<0.01、)。Western Blotting结果显示，B组肾组织OPN蛋白表达明显高于A组(P<0.01)，C组明显低于B组(P<0.01)。RT-PCR半定量结果显示，B组OPN mRNA表达较A组显著增高(P<0.01)，C组的表达较B组明显降低(P<0.01)。 5 氟伐他汀对高糖环境中人近端肾小管上皮细胞骨调素表达的影响 结论：1、无论糖尿病大鼠肾小管间质，还是高糖环境下培养的人近端肾小管上皮细胞OPN的表达均增高，提示OPN过表达可能参与了糖尿病肾小管间质损害的发展过程。糖尿病状态下，肾间质单核巨噬细胞浸润，细胞外基质进行性积聚等肾脏病理改变可能与OPN表达异常有关。2、OPN’反义寡核苷酸能够特异性地抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞OPNmRNA及蛋白表达，进而抑制Ⅲ型胶原分泌，表明OPN可能在高糖诱导的肾小管上皮细胞胶原Ⅲ合成方面发挥重要作用。3、HMG-CoA还原酶抑制剂氟伐他汀能够抑制糖尿病大鼠肾小管间质OPN表达，下调肾间质ED-1及Ⅲ型胶原过表达，降低糖尿病大鼠尿微量白蛋白及尿NAG，减轻肾小管间质病理学改变。4、氟伐他汀可抑制高糖培养的人近端肾小管上皮细胞OPN表达增多，减少Ⅲ型胶原的合成，提示氟伐他汀的肾脏保护作用可能与抑制OPN的表达有关，该保护作用并不依赖于其降脂的效应。