论文部分内容阅读
目的:检测人成熟角膜上皮细胞在体外向干细胞逆向分化的可行性及关键因素。方法:选取同济医院眼库中捐献者的正常角膜,人体组织的使用符合赫尔辛基宣言并经同济医院伦理委员会批准。用Dispase Ⅱ酶消化得到成熟角膜上皮(MCEC);应用石蜡包埋切片或0.25%trypsin/1 m M EDTA(T/E)消化-甩片以及免疫荧光染色法,检测CK12和p63α在MCEC中的表达情况,以角膜缘上皮做对照。采用胶原酶A消化法自角膜缘体外分离、培养角膜缘微环境细胞(LNC)。实验组(3D-MCEC+LNC组)将传代培养的第4-6代LNC与MCEC按1:4混合,在50%基质胶(Matrigel)构建的三维(3D)环境下共培养;对照组(3D-MCEC组)将MCEC单独3D培养。培养10天后,用细胞甩片、免疫荧光染色双标法,检测CK12、p63α、PCK、Vimentin的表达情况。表达强度采用Image J、Graphpad Prism 7.0软件进行图像分析、数据处理,细胞均数以(?)表示,采用Student’s t-检验比较组间差异,P<0.05具有统计学意义。结果:在石蜡切片免疫荧光染色中,MCEC高表达CK12,阳性率为100%,基底部胞核表达p63α,阳性率为22.76±2.66%;与此相对比,角膜缘上皮层细胞表达CK12阳性率为38.73±23.28%,p63α阳性率为84.42±2.33%。角膜缘上皮细胞p63α阳性率与MCEC比较,差异有统计学意义(P=0.000)。3D-MCEC组的细胞在72小时内逐渐聚集成球形结构,但在后续培养过程中细胞数量逐渐减少;培养第10天,细胞分散不均匀,只有少量细胞聚集成细胞球,球体形状不规则,直径为52.01μm~180.32μm,平均109.39±34.85μm。3D-MCEC+LNC组的细胞24小时聚集成球体,培养第10天,球体形态趋近圆形,直径为129.06μm~306.20μm,平均212.24±57.91μm,与3D-MCEC比较,细胞球直径差异有统计学意义(P=0.000)。将球体用T/E消化成单个细胞进行免疫荧光染色,3D-MCEC组中的CK12阳性率为24.06±8.85%,p63α表达全部阴性;3D-MCEC+LNC组中,CK12阳性率为52.95±20.99%,p63α阳性率为35.58±8.11%。两组分别与MCEC比较,CK12的表达均降低(3D-MCEC组P=0.005,3D-MCEC+LNC组P=0.000),但两组间比较没有统计学意义(P=0.051)。同时3D-MCEC+LNC组和MCEC相比,p63α表达增加,差异有统计学意义(P=0.043),其中p63α+/CK12-细胞比例为11.51±3.76%。3D-MCEC+LNC组培养第10天的细胞球免疫荧光染色显示,细胞球内可见PCK+/Vim-及PCK-/Vim+细胞。提示球形体由上皮和LNC来源的两种细胞构成,即MCEC和LNC在3D环境中聚集。结论:人成熟角膜上皮细胞在“3D基质胶+LNC”体外构建的培养环境中具有向角膜缘干细胞逆分化的趋势。