目的 暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure，FHF)是病毒性肝炎死亡的主要原因，严重危害着人体健康，其发病机制复杂，至今尚未完全阐明。近年来的研究表明，肝细胞凋亡和肝细胞坏死有着非常密切的关系，但在暴发性肝衰竭中肝细胞凋亡的确切机制尚不十分清楚。已有的研究表明，TNF-α和NO对肝细胞凋亡均具有重要作用，在TNF-α诱导肝衰竭的实验研究中肝细胞凋亡与肝细胞坏死有着非常密切的联系，而NO一方面可诱导多种细胞发生凋亡，另一方面在某些条件下又对细胞凋亡起抑制作用。本研究通过动态观察，对TNF-α和NO在暴发性肝衰竭动物模型肝细胞凋亡中的作用进行研究，旨在从细胞凋亡的角度进一步探讨TNF-α和NO在暴发性肝衰竭中的作用。 有许多基因在肝细胞凋亡中起着调控的作用，通过这些基因的作用，肝细胞凋亡才能得以发生。细胞凋亡的调控基因包括Caspase家族、Bcl-2家族、Fas系统等，其中Caspase的作用尤为重要，被誉为“凋亡刽子手”或“凋亡步兵”，在肝细胞凋亡中起着关键性的作用。Fas系统和Bcl-2家族成员在肝细胞凋亡中的作用亦不容忽视，有研究表明，在肝脏疾病中，肝细胞的凋亡主要是通过Fas/FasL途径介导所致，而Bcl-2为重要的抗凋亡因子，定位于线粒体膜的Bcl-2蛋白可通过调节线粒体功能而制约着凋亡的发生。在对Bcl-2和Fas调控细胞凋亡的研究中发现，Caspase-3的激活在其中起着重要的作用。本研究通过对上述调控基因在暴发性肝衰竭中对肝细胞凋亡的作用研究，进一步探讨肝细胞凋亡的发生机制，为临床治疗提供一定的实验依据。材料与方法 实验动物为雄性昆明小鼠，体重20一259，根据4种不同处理对其进行分组，其中28只联合应用LPS和D一GdN，为模型组;28只联合应用IJS、D一GalN和抗TNF一a抗体，为抗TNF一a组;28只联合应用L玲、D-GalN和iNOS的抑制剂L一NMMA，为抗NO组;20只注射同样体积的生理盐水，为对照组。各组均于给药后2、4、8、12小时分别采取血和肝脏标本(模型组、抗TNF一a组和抗NO组每个时间点为7只小鼠，对照组每个时间点为5只小鼠)，进行以下检测。 一、应用生化方法检测血清ALT和TBil水平，并对肝组织进行IIE染色，以明确肝细胞坏死程度和生化变化。 二、肝细胞凋亡的检测:应用酚氯仿提取法在冻存的肝组织中提取DNA，去除RNA后于0 .7%琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形带，并应用原位末端脱氧核昔酸转移酶标记法(，rU NEL)对石蜡包埋的肝组织切片进行凋亡细胞的检测，DAB显色后细胞核呈棕褐色染色的为阳性细胞，于显微镜下判断阳性程度。 三、TNF一a和NO的检测:应用异硫氰酸肌一酚一氯仿方法提取肝组织RNA后，逆转录合成cDNA，再行PCR反应检测肝组织TNF一。mRNA及肝组织iNOSmRNA表达，引物序列如下:TNF一a一1 5丁一ACCAGAGCGGCAAGAAGAACCAT一3‘;TNF一a一25‘一CATCA-GACATCGGAGGCAGGAAG一3‘(产物长329bp)，iNOS一1 5‘一TCGGTGCAGTC『l’1’ltl’CCTATGG一3‘;iNOS一25‘一TATTAGAGCGGCGGcATGGT一3‘(产物长404bp)，同时设内参照，进行，rNF一。mRNA及iNOSmRNA表达的定量检测。用EUSA方法检测血清，INF一a水平，采用硝酸还原酶法检测血清NO水平，明确翎F一。和NO在暴发性肝衰竭模型中的动态变化。 四、应用免疫组化技术检测Bcl一2和Fas在肝组织中的表达，DAB显色后细胞浆呈棕褐色染色的为阳性细胞，于显微镜下判断阳性程度。 五、应用原位杂交的方法检测CasPase一3在肝组织中的表达，Caspase一3寡核昔酸探针序列如下: (l)5’一AGGATAATCCA‘l’1’l“l人TAACTGTTGTCCAG一3‘; (2)5’一TCCAg件CT创队CCACGGCAGGCCTGAATA一3‘; (3)5‘一GACTCAAATTCTGTTGCCACCTTrCGGTTA一3‘，DAB显色后细胞浆呈棕褐色染色的为阳性细胞，于显微镜下判断阳性程度。结果 一、暴发性肝衰竭动物模型的建立:经动态观察，小鼠经给予LpSIO林扩kg+D一G滋N 80Om岁kg后12h内无死亡，用药后8h可有点片状肝细胞坏死，12h则见肝细胞大块状坏死，同时伴有血清ALT和TBil的显著升高，符合暴发性肝衰竭的病理和生化改变。肝细胞凋亡的检测结果表明，模型组8h可见典型的DNA梯形带，且TUNEL检测阳性细胞增加最显著，12h则出现坏死带，，rU NEL检测亦存在较多的阳性细胞，但较 sh时减少，二者比较P<0 .05。 二、TNF一a在暴发性肝衰竭中对肝损伤及肝细胞凋亡的作用:模型组2h、4h、8h血清TNF一a水平、肝组织，rNF一amRNA的表达均显著升高，与各时间点的对照组比较P<0.01，尤以2h升高最为显著，以后逐渐下降。抗TNF一a组血清TNF一a水平及肝组织TNF一amRNA的表达均为正常水平。模型组4h、sh、12h，ALT、TBil均明显升高，与各时间点对照组相比有显著差异，p<0.01，其中sh、12h升高更明显，与4h相比p<0.01。抗TNF一a组各时间点ALT、TBil水平均为正常水平。抗TNF一。组各时间点均无DNA梯形带或坏死带的出现，TUNEL检测仅出现少量阳性细胞。 三、NO在暴发性肝衰竭中对肝损伤及肝细胞凋亡的作用:模型组2h