氟喹诺酮类药物是治疗侵袭性沙门氏菌感染的重要药物。在沙门菌中,氟喹诺酮类耐药性的发展往往是多种耐药机制的累积和协同作用的结果。AcrB是一个重要的多重耐药蛋白,已有研究表明其与细菌对氟喹诺酮类药物的耐药性有关。为了了解临床耐药沙门菌中外排蛋白AcrB在细菌对氟喹诺酮耐药发展过程中的作用和作用机制,本研究开展了以下实验。选取了实验室保存的108株于2009年至2014年分离自动物临床的具有不同环丙沙星耐药水平的沙门菌,对菌株的acr B基因进行了突变位点的检测。研究发现,所有环丙沙星高水平耐药菌株均携带AcrB突变。其中,12株（54.5%,12/22）携带AcrBP319L突变,10株（45.5%,10/22）携带AcrBM78I/P319L双突变。药物敏感性检测结果显示,所有携带AcrB突变的菌株均为多重耐药菌。对携带AcrB突变的菌株进行了喹诺酮耐药机制和广谱头孢菌素耐药机制的检测,包括QRDR突变、PMQR基因和超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因的检测。结果显示,所有携带AcrB突变的菌株均检测到gyr A双突变和par C单突变。PMQR基因的检测结果显示,aac（6’）-Ib-cr的检出率最高（77.3%）,其次是oqx AB（50%）。在携带AcrBM78I/P319L双突变的菌株中,oqx AB的检出率较高（90%）。当PAβN存在时,菌株对氟喹诺酮类药物的MIC值降低2～64倍,表明外排泵对沙门菌高水平氟喹诺酮耐药性的产生具有重要的作用。此外,所有的携带AcrBM78I/P319L双突变菌株均对广谱头孢菌素耐药,而且耐药性的产生主要是由于携带了含有blaCTX-M-27的类P1噬菌体。研究构建了AcrBWT、M78I、P319L和M78I/P319L蛋白的表达载体。检测了不同AcrB突变体的生长曲线和对0.1%、1%胆盐的耐受能力;检测了构建菌株对不同AcrB底物的敏感性。研究结果显示,携带AcrBP319L和AcrBM78I/319L突变的菌株对高浓度胆盐更耐受。AcrB突变体的药物敏感性结果显示,AcrBM78I和P319L突变均可增强细菌对氟喹诺酮类药物、红霉素、新生霉素和胆盐的耐药性。使用圆二色谱检测了不同AcrB蛋白在195～250nm波长范围内的圆二色光谱曲线和在4℃～98℃温度范围内的稳定性;采用BN-PAGE实验检测了AcrB三聚体结构的稳定性。圆二色光谱结果表明,沙门菌的AcrB蛋白与大肠杆菌的AcrB蛋白的二级结构的组成是有差异的。AcrBM78I和AcrBP319L对AcrB的圆二色光谱的影响较小。AcrBM78I/P319L双突变与AcrBWT的差异相对较大。根据θ222nm/θ208nm的比值,我们猜测AcrBM78I/P319L双突变体蛋白的某些局部结构发生了变化,其无规卷曲的比例相比于AcrBWT有所增加。热稳定性研究结果表明,尽管大肠杆菌AcrBWT与沙门菌AcrBWT的氨基酸序列相似性很高（95%）,但是大肠杆菌AcrBWT的热稳定性比沙门菌的AcrBWT低,它们的熔解温度分别为60.2℃和63.9℃。沙门菌AcrBP319L（63.0℃）突变体的熔解温度比AcrBWT的降低了近1℃,而AcrBM78I/319L（63.4℃）双突变的熔解温度又有所恢复,这在一定程度上说明突变引起了蛋白某些局部结构的变化。BN-PAGE结果表明,大肠杆菌AcrB蛋白的三聚体稳定性要远远高于沙门菌AcrB三聚体的稳定性。AcrBM78I和P319L突变没有改变AcrB三聚体的稳定性。通过同源建模获得了沙门菌AcrB和Acr AB蛋白的模拟结构。通过定点突变对AcrBM78I的耐药机制进了研究;采用BODIPY-FL-马来酰胺荧光底物标记的方法研究了AcrBM78I突变对底物转运通路中重要的底物结合位点与底物结合能力的影响。研究表明,AcrBM78I突变体的耐药性增强是由于78位的氨基酸疏水性增强引起的。荧光标记实验结果显示,AcrB的78位氨基酸不参与和底物的直接结合。AcrBM78I的突变使得底物与外排通路中的某些氨基酸位点结合增强（如位点Q89、E673和F617）,而对另一些氨基酸的结合减弱（如S134和N274）。通过对Acr A中367位和368位氨基酸进行定点突变,并分析其药物敏感性和AcrB的319位P和L分别与它们的结构关系发现,AcrBP319L的突变导致细菌的耐药性增加,是因为氨基酸L比P具有更长和更灵活的侧链,这使得AcrB与Acr A的相互作用更灵敏,使AcrB的功能性蠕动更加灵活,从而具有更高效的底物外排能力。综上所述,本研究表明AcrBM78I和P319L的突变对临床沙门菌的高水平氟喹诺酮类药物耐药性和多重耐药性具有重要的作用。AcrBM78I和P319L突变的产生具有一定的流行性。更多的研究需要致力于对临床菌株中AcrB的突变情况进行检测。