幽门螺杆菌培养方法及其尿素酶纯化的研究

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目的 探讨大量培养H.pylori的方法,提取纯化尿素酶。方法 固体培养复苏和传代时分别观察不同添加剂(10%SB、10%SBS和0.1%β-CD)、暴露时间(1h和3h)和抽气负压(-0.075Mpa、-0.070Mpa和-0.065Mpa)对H.pylori培养的影响;液体培养时观察四种添加剂(5%CBS、10%CBS、10%SBS和0.1%β-CD)对H.pylori培养的影响。比较各培养方法的效费关系。用旋涡振荡和冻融法粗提尿素酶,再用阴离子交换、疏水相互作用和阳离子交换三步层析法纯化,测定酶活性,计算总蛋白回收率。用SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果 固体培养复苏4天,10%SB、10%SBS和0.1%β-CD组每板分别可获H.pylori0.0618g、0.0576g和0.0335g;传代培养3天,分别可获0.0802g、0.0922g和0.0447g。无论复苏或传代,10%SB和10%SBS组H.pylori产量均无统计学差异(P>0.05),但均优于0.1%β-CD组(P<0.01);不同暴露时间及抽气负压H.pylori产量均无统计学差异(P>0.05)。液体培养3天,5%CBS、10%CBS、10%SBS和0.1%β-CD组的OD650值分别为0.2532、0.3705、0.3173和0.2336,10%CBS与10%SBS组均高于0.1%β-CD组(P<0.05),10%CBS组高于5%CBS组(P<0.01)。10%SBS固体培养组每获1g H.pylori所需费用和相对培养批次数分别为24.23元和1.00批次,10%SB固体培养组与其相近(26.28元和1.14批次)。最后纯化得到的尿素酶活性为19.7 urea/mg/min,总蛋白回收率为2.58%,SDS-PAGE显示出66kDa和30kDa的蛋白条带,Western blotting显示其可与兔抗H.pylori全菌血清反应。结论 添加10%SB和10%SBS的固体培养可获得较高的H.pylori产量;使用三步层析法可大量快速地纯化尿素酶。
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