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背景与目的:脑梗死是一种严重危害人类健康和生命的常见病,其发病率、死亡率及致残率正在逐年升高。脑梗死多与颅内动脉的粥样斑块形成有关,可见动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）在脑梗死的发生发展过程中占有极其重要的地位。既往研究表明血管内皮细胞的损伤及功能障碍是AS的最早期病理改变,损伤的血管内皮细胞往往会释放出大量细胞炎性因子,从而促进血液中的炎性细胞聚集,扩大损伤范围。可见有效遏制血管内皮细胞的炎性损伤有利于减少动脉粥样斑块的形成。近年,在全基因组关联研究中发现,位于染色体7p21.1上的组蛋白去乙酰化酶9（Histone deacetylase 9,HDAC9）基因序列与AS引起的疾病密切相关。已有研究指出HDAC9可能通过介导血管内皮细胞的炎性损伤导致AS。目前HDAC9介导血管内皮损伤的分子机制尚未明确,但是已有研究证实HDAC9能通过小鼠胶质细胞中的p38丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK）通路介导大脑缺血诱发的神经细胞损伤,由此推断在血管内皮细胞中HDAC9可能也通过P38 MAPK通路介导炎性损伤。丙戊酸钠（Sodium valproate,SVA）作为抗癫痫的常规用药,其临床安全性和稳定性已被认可,且SVA抑制HDAC9活性和抗炎作用已被证实,则其可能通过拮抗血管内皮细胞炎性损伤,从而减少动脉粥样斑块的形成,成为防治脑梗死的潜在药物。综上所述,本研究旨在探讨HDAC9对ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎性损伤的影响及分子调控机制。同时,验证HDAC9的抑制剂SVA对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响,从而为SVA临床防治脑梗死提供理论依据。方法:1、ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤通过CCK-8法检测筛选出构建EA.HY926细胞损伤模型的最适浓度;EA.HY926细胞分两组,即对照组（control组）和ox-LDL组,利用流式细胞凋亡实验检测两种细胞早、晚期凋亡情况;通过Western blot实验比较以上两组细胞中HDAC9、P38 MAPK、p-P38MAPK、肿瘤坏死因子a（Tumor necrosis factor-a,TNF-a）和单核细胞趋势因子1（Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）的表达水平。2、HDAC9对血管内皮细胞损伤的影响通过Western blot实验分别检测不同浓度ox-LDL作用下HDAC9的表达水平;将EA.HY926细胞分为6组,即control组、sh Vector组、shHDAC9组（HDAC9敲低组）、ox-LDL组、sh Vector+ox-LDL组和shHDAC9+ox-LDL组,以CCK-8法分别检测各组细胞活力;通过流式细胞凋亡实验分别检测以上6组的细胞早、晚期凋亡情况;通过Western blot实验检测同上6组样本中的同上5种蛋白的表达量。3、HDAC9通过P38 MAPK通路介导血管内皮细胞损伤利用CCK-8法筛出SB203580拮抗ox-LDL作用的最适浓度;将EA.HY926细胞分为4组,即control组、SB203580组、ox-LDL组以及SB203580+ox-LDL组,检测方法同方法1。4、SVA拮抗P38 MAPK通路介导的血管内皮细胞损伤通过CCK-8法筛出SVA拮抗ox-LDL作用的最适浓度;将EA.HY926细胞分为4组,即control组、SVA组、ox-LDL组和SVA+ox-LDL组,检测方法同方法1。结果:1、ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤以不同浓度的ox-LDL处理EA.HY926细胞24h,通过CCK-8法检测每组细胞的生存率,结果表明:EA.HY926细胞活力随ox-LDL作用浓度的增加而降低,当ox-LDL作用浓度为150μg/ml时,细胞生存率约下降50%,且150μg/ml组与control组细胞生存率差异具有统计学意义（P<0.01）,故以该浓度做为后续实验中构建EA.HY926细胞损伤模型的浓度。对照组（control组）和ox-LDL组的流式细胞凋亡实验检测结果表明:ox-LDL组细胞凋亡率明显高于control组,两组差异具有统计学意义（P<0.01）。同时,通过Western blot实验比较以上两组细胞中HDAC9、p-P38MAPK、TNF-a和MCP-1的表达水平,结果显示:ox-LDL组中HDAC9、p-P38MAPK、TNF-a和MCP-1的表达水平均高于Control组,两组间以上4种蛋白的表达差异均具有统计学意义（P（27）0.01）。2、HDAC9对血管内皮细胞损伤的影响以不同浓度的ox-LDL处理EA.HY926细胞24小时后,Western blot实验结果显示:HDAC9在EA.HY926细胞中的表达量随ox-LDL浓度的增加而升高,不同ox-LDL浓度的各组进行两两比较,组间差异均有统计学意义（P<0.01）。CCK-8实验结果表明:敲低HDAC9能提高EA.HY926细胞活力,其中shHDAC9组的细胞生存率高于control组,两组差异具有统计学意义（P（27）0.05）;shHDAC9+ox-LDL组的细胞生存率较ox-LDL组也有明显改善,两组差异具有统计学意义（P（27）0.01）。流式细胞凋亡实验结果表明:shHDAC9+ox-LDL组细胞凋亡率显著低于ox-LDL组,两组差异具有统计学意义（P（27）0.01）。同时,Western blot实验结果表明:敲低HDAC9对P38 MAPK的表达无影响,比较以上6组间P38 MAPK的表达差异无统计学意义（P=0.998）,敲低HDAC9仅影响p-P38 MAPK及该通路效应因子（TNF-a和MCP-1）的表达,即shHDAC9+ox-LDL组中以上4种蛋白（HDAC9、p-P38 MAPK、TNF-a和MCP-1）表达水平均较ox-LDL组低,组间差异均具有统计学意义（P<0.01）。3、HDAC9通过P38 MAPK通路介导血管内皮细胞损伤利用CCK-8法检测筛选出SB203580拮抗ox-LDL的最适浓度为6μM。流式细胞凋亡实验结果表明:SB203580能降低ox-LDL诱导的细胞凋亡,即SB203580+ox-LDL组细胞凋亡率低于ox-LDL组,两组差异具有统计学意义（P<0.01）。Western blot实验结果表明:SB203580的存在不影响细胞中HDAC9的表达,而该抑制剂对ox-LDL的拮抗作用是通过降低P38 MAPK磷酸化水平实现的,即SB203580+ox-LDL组与ox-LDL组间HDAC9表达差异无统计学意义（P=0.912）;SB203580+ox-LDL组中p-P38 MAPK、TNF-a和MCP-1的表达水平均低于ox-LDL组,组间差异均具有统计学意义（P<0.01）。4、SVA拮抗P38 MAPK通路介导的血管内皮细胞损伤通过CCK-8法筛出SVA拮抗ox-LDL作用的最适浓度为4μM。流式细胞凋亡实验结果显示:SVA能降低ox-LDL诱导的细胞凋亡,即SVA+ox-LDL组细胞凋亡率低于ox-LDL组,两组差异具有统计学意义（P<0.01）。Western blot实验结果表明:SVA不影响细胞中HDAC9的表达,而该抑制剂对ox-LDL的拮抗作用与其降低HDAC9去乙酰化活性,导致组蛋白H3K9乙酰化水平升高有关,即SVA+ox-LDL组与ox-LDL组间HDAC9表达差异无统计学意义（P=1）;SVA+ox-LDL组中p-P38 MAPK、TNF-a和MCP-1的表达水平均低于ox-LDL组,组间差异均具有统计学意义（P<0.01）;control组中乙酰化组蛋白H3K9的表达水平高于ox-LDL组,组间差异具有统计学意义（P<0.01）;SVA组中乙酰化组蛋白H3K9的表达水平高于control组,组间差异具有统计学意义（P<0.01）;SVA+ox-LDL组中乙酰化组蛋白H3K9表达水平高于ox-LDL组,组间差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:1、HDAC9通过P38 MAPK磷酸化激活P38 MAPK信号通路,从而介导血管内皮细胞炎性损伤。2、SVA能通过抑制HDAC9的活性拮抗ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎性损伤,这使其成为防治脑梗死的潜在药物。