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第一部分 吸烟与白念珠菌感染对口腔黏膜上皮细胞增殖的影响[目的]吸烟是多种口腔黏膜疾病发生的危险因素,香烟烟雾中有大量毒性物质,对口腔黏膜上皮产生破坏作用,造成的口腔黏膜局部防御能力的降低会增加口腔念珠菌感染的可能性。白念珠菌是口腔中最常见的机会致病性真菌,当宿主免疫功能低下时,白念珠菌从共生状态发展为致病状态,对口腔黏膜上皮细胞造成损伤。本研究的目的是探究香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract,CSE）及不同比例白念珠菌感染口腔黏膜上皮细胞对其增殖的影响。[方法]体外培养永生化口腔黏膜上皮细胞系Leuk-1,采用实时无标记细胞分析技术（real-time cell assay,RTCA）和四甲基偶氮唑盐（2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）比色法检测不同浓度 CSE（0,4%,8%,16%,32%,64%）处理 Leuk-1细胞24h对其增殖性能的影响,以确定合适的CSE浓度。采用RTCA技术实时监测CSE及不同比例白念珠菌（Leuk-1细胞与白念珠菌孢子比例分别为1:16、1:4、1:1、4:1、16:1）对Leuk-1细胞增殖的影响。实验选用白念珠菌标准株SC5314。处理分三组,第一组为CSE处理Leuk-1细胞24h,第二组为Leuk-1细胞与白念珠菌按不同比例共培养,第三组为CSE处理Leuk-1细胞24h后,再与白念珠菌按不同比例共培养,同时设置Leuk-1细胞空白对照组,对比分析CSE处理对白念珠菌影响口腔黏膜上皮细胞增殖性能的差异。[结果]RTCA对不同浓度CSE作用于Leuk-1细胞的检测结果显示,4%、8%、16%CSE处理Leuk-1细胞24h内的细胞指数（cell index,CI）随着时间的持续未有明显变化;32%CSE处理Leuk-1细胞24h内CI值随时间持续出现先增大后不断减小的趋势;64%CSE处理Leuk-1细胞24h内CI值持续减小。MTT实验结果显示,当CSE的浓度为32%和64%时,细胞生长被明显的抑制。因此在后续实验中所用CSE浓度确定为16%。从RTCA曲线中可以看出,CSE处理后白念珠菌共培养组相比于无CSE处理白念珠菌共培养组,白念珠菌对细胞增殖的抑制作用出现得更早,抑制作用更明显,五组不同比例均呈现出一致的趋势,且当白念珠菌比例更高时,抑制作用更加明显。[结论]吸烟削弱了口腔黏膜上皮细胞的防御功能,使其对白念珠菌的防御能力降低,细胞的生长与增殖受到明显的抑制作用。第二部分 香烟烟雾提取物处理对口腔黏膜上皮细胞防御能力的影响[目的]吸烟造成的口腔黏膜局部防御能力的降低可增加口腔黏膜局部微生物的数量,增加念珠菌感染的可能性。白念珠菌是口腔中最常见的条件致病性真菌,有3种形态,包括酵母态、假菌丝、菌丝态。一般以酵母态定植于人体黏膜表面,无致病性;当它在一定条件下转化为菌丝时,对上皮细胞的黏附性能加强,产生侵袭和破坏作用。本研究将探讨CSE处理口腔黏膜上皮细胞后对白念珠菌菌丝生成、菌落形成的影响,以评价口腔黏膜上皮细胞的防御功能。[方法]分别将经CSE处理24h和不经CSE处理的Leuk-1细胞与白念珠菌SC5314孢子以不同比例（1:16、1:4、1:1、4:1、16:1）37℃恒温培养,同时设置培养基诱导菌丝组,每隔1h观察白念珠菌芽管生成情况,并测量和比较各组菌丝长度;在共培养24h时观察各组白念珠菌的菌落形成情况,并对菌落图做光密度分析。[结果]共培养1h后,白念珠菌细胞从酵母形态开始长出长短不一的芽管,2h后菌丝继续延长。对比各组菌丝长度发现,按4:1比例共培养3h时,CSE处理后白念珠菌共培养组菌丝长于无CSE处理白念珠菌共培养组,具有统计学差异。共培养24h时对比菌落图像光密度值发现,当细胞与白念珠菌孢子的比例为4:1时,CSE处理后白念珠菌共培养组菌落比无CSE处理白念珠菌共培养组显著增多,具有统计学差异。[结论]CSE处理可降低口腔黏膜上皮细胞的防御能力,促进白念珠菌菌丝生长和菌落形成,使白念珠菌侵袭加剧。第三部分 吸烟与白念珠菌感染对口腔黏膜上皮细胞固有免疫因子分泌水平的影响[目的]吸烟削弱口腔黏膜的局部免疫,加剧了白念珠菌等致病微生物的侵袭和感染。吸烟对口腔黏膜上皮造成的物理、化学和生物毒性作用,可改变细胞因子、抗微生物肽等固有免疫因子的表达和分泌,从而影响固有免疫系统对病原微生物等其他刺激因素的防御能力。在本实验中,我们建立了白念珠菌感染口腔黏膜上皮细胞的模型,用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测细胞上清中固有免疫相关因子的分泌水平,目的是研究吸烟与白念珠菌感染对口腔黏膜上皮细胞固有免疫的影响。[方法]处理分三组,第一组为CSE处理Leuk-1细胞24h,第二组为Leuk-1细胞与白念珠菌按1:4共培养24h,第三组为CSE处理Leuk-1细胞24h后,再与白念珠菌按1:4共培养24h,同时设置Leuk-1细胞空白对照组。收集细胞上清,ELISA法检测细胞上清中口腔黏膜上皮细胞固有免疫相关因子的蛋白浓度,包括IL-6、IL-8、IL-22、LL-37。[结果]CSE处理Leuk-1细胞24h后,IL-6、IL-8、IL-22、LL-37均出现明显的变化。白念珠菌共培养组的细胞上清中IL-6、IL-8、IL-22、LL-37均较对照组明显升高,经CSE处理白念珠菌共培养组中IL-6、IL-8、IL-22、LL-37较无CSE处理白念珠菌共培养组下降,均具有统计学差异。[结论]吸烟通过影响口腔黏膜上皮细胞固有免疫因子的分泌水平,降低其对微生物的防御功能,从而加剧了白念珠菌等微生物的侵袭。