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本文以J1小鼠胚胎干细胞(以下简称ES细胞)为研究模型,利用终浓度为3μM的CHIR99021(简称CHIR)和等体积的DMSO处理小鼠J1 ES细胞24 h后,对CHIR99021处理后的小鼠J1 ES细胞进行表达谱芯片分析,寻找CHIR99021维持小鼠J1 ES细胞干性的差异基因,利用CLUSTER3.0软件和DAVID数据库分别对差异表达基因聚类分析和功能注释,并利用双荧光素酶报告系统和实时定量PCR技术对差异基因进行验证,揭示CHIR99021通过调控蛋白编码基因的表达促进小鼠胚胎干细胞自我更新和多能性维持的机制。主要研究结果如下:1.本实验确定了CHIR99021处理小鼠J1 ES细胞的最佳浓度。采用不同浓度(0、1、3、5、10、15μM)的CHIR99021处理小鼠J1 ES细胞24 h。实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)和免疫荧光染色结果表明,与对照细胞相比,3μM CHIR99021处理的细胞中Nanog表达增强,而5,10或15μM CHIR99021处理的小鼠J1 ES细胞中Nanog的表达并没有进一步加强。细胞增殖及细胞毒性检测(cell proliferation and cytotoxicity assay)结果表明,与对照细胞相比,10或15μM CHIR99021处理3天的细胞,其细胞活力降低,相反,用5μM以下(含5μM)CHIR99021处理的细胞的活力与对照细胞的类似。因此,小鼠J1 ES细胞的最佳CHIR99021的处理浓度为3μM。2.CHIR99021和白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)共同作用可以维持小鼠J1 ES细胞的细胞形态,并且上调小鼠J1 ES细胞标志基因的表达。终浓度为3μM的CHIR99021处理小鼠J1 ES细胞,并用等体积的DMSO处理的ES细胞作为对照。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色结果表明,CHIR99021处理的小鼠J1 ES细胞表现出更高水平的碱性磷酸酶活性。免疫荧光染色(immunofluorescent Staining)结果表明CHIR99021可以上调Nanog的表达。免疫荧光染色和蛋白免疫印迹(immunoblotting)结果显示,CHIR99021处理的细胞,β-catenin表达显著增强,双荧光素酶报告分析系统(dual-luciferase reporter assay system)结果表明CHIR99021处理后小鼠ES细胞中的Wnt通路活性增强。3.对CHIR99021处理后的小鼠J1 ES细胞进行表达谱芯片分析,寻找差异表达基因,进一步揭示CHIR99021维持ES细胞干性的机制。芯片数据证明,CHIR99021能够显著上调干性相关基因的表达,同时也能下调分化相关转录因子的表达。利用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)在线软件对筛选出的差异表达基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,发现CHIR99021不仅能通过Wnt/β-catenin通路,同时也能通过其它通路如TGF-β和BMP等来促进小鼠J1 ES细胞的自我更新和多能性维持。4.CHIR99021通过抑制Nodal通路和促进Bmp4表达来增强BMP通路。定量PCR分析CHIR99021和SB431542(简称SB)处理及对照细胞中的Nodal,Smad7,BMP4及下游调控基因Lefty1,Lefty2和Ids的表达变化。结果表明,Nodal通路相关的基因表达下调,而BMP通路相关的基因表达上调。蛋白免疫印迹检测CHIR99021和SB431542处理及对照细胞中的Smad2和Smad1/5的磷酸化水平,结果与定量PCR结果一致。Dorsomorphin(Dorso)是BMP信号的小分子抑制剂,可阻断BMP介导的Smad1/5的磷酸化作用。CHIR99021和Dorso相关的实验结果表明,CHIR99021处理后细胞形态的维持需要BMP信号的活化。5.CHIR99021影响小鼠J1 ES细胞的表观遗传修饰。CHIR99021能够通过调控表观遗传相关基因,如Dnmt3l,Dnmt3a,Dnmt3b,Hdac9,Smarcal1和Cbx7的表达,改变ES细胞的表观遗传修饰。芯片和定量PCR结果表明,CHIR99021能下调Dnmt3l,Dnmt3a,Dnmt3b,Hdac9和Smarcal1的表达并上调Cbx7的表达。与转染NC-FAM的细胞相比,β-catenin敲降细胞中Dnmt3l的表达显著上调。据此推测,Dnmt3l可能是β-catenin的一个下游靶标。其他表观遗传调控基因可能不是β-catenin的下游靶标,但是可以被CHIR99021调节。综上所述,本研究表明小分子化合物CHIR99021可以通过调控蛋白编码基因的表达来促进小鼠J1 ES细胞的自我更新和多能性维持,进一步揭示了CHIR99021促进小鼠ES细胞的自我更新的机制,并且为CHIR99021诱导多能性干细胞(iPS)重编程方面的研究提供了理论基础。