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α干扰素(IFN-α)是一类具有抗病毒活性、免疫调节活性、抗肿瘤活性的细胞因子,主要来源于浆细胞样树突状细胞(pDCs)。多项研究证实,猪α干扰素(pIFN-α)能在体内和体外抑制多种病毒的增殖,具有良好的疗效。从白细胞分离IFN-α是制备IFN-α常用的一种方法,但存在成本高、安全性低、质量控制不统一、以及疗效不稳定等缺点。开发高活性、低成本、易于规模生产的重组猪干扰素(rPoIFN-α)制剂对防治猪的病毒性疫病具有重要意义。本研究采用毕赤酵母菌KM71表达系统获得rPoIFN-α,并进行了纯化和冻干,体内外试验结果显示其具有较强的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制作用,表明rPoIFN-α在猪病毒性疾病防控方面具有重要应用前景。主要内容如下:1.重组猪α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的高效发酵表达与纯化采用7L高密度发酵和Do-Stat反馈控制模式,进行毕赤酵母菌KM71培养及诱导表达,建立了毕赤酵母中高效分泌表达rPoIFN-α工艺技术。并依次用亲和层析方法、离子交换方法、分子筛三种柱层析方法进行了纯化,用SDS-PAGE进行纯度检测。结果表明,诱导84h时,rPoIFN-α表达量最高,达650.3 μg/mL,抗病毒活性为1.09×106 IU/mg。经三步纯化后rPoIFN-α的纯度为95%,SDS-PAGE显示在17 kD分子量处有目的条带。rPoIFN-α抗水泡性口炎病毒活性为5.63×106IU/mg。2.重组猪α干扰素的真空冷冻干燥工艺研究采用真空冷冻干燥技术制备rPoIFN-α冻干制品,通过外观检测、水分含量及活性检测,观察了 14种冻干保护剂的冻干效果,结果为:采用终浓度2%、4%和5%的甘露醇的保护效果较好,活性保持率分别为102.8%,95.1%,108.3%。然后采用这三个配方再冻干三批制品,进行40℃放置加速稳定性试验,结果表明,三个保护剂制品在40℃放置三个月,效价无明显降低,证明其稳定性良好,有效期可定为两年,为rPoIFN-α产品制备奠定了基础。3.重组猪α干扰素体外抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的研究采用细胞病变抑制方法,检测rPoIFN-α对PRRSV的抑制作用。结果显示将rPoIFN-α预先处理 Marc145 细胞后 24 h 再接种 PRRSV,341 IU/mL 的 rPoIFN-α可以完全抑制PRRSV的增殖;将PRRSV预先感染Marc145细胞后24 h,再接种rPoIFN-α,1367 IU/mL的rPoIFN-α可以完全抑制PRRSV的增殖;将2倍倍比稀释的rPoIFN-α分别感作Marc145细胞后24 h,再将10倍倍比稀释的PRRSV分别感染Marc145细胞,观察rPoIFN-α对PRRSV感染力的影响,结果显示随着rPoIFN-α稀释度的增大,对PRRSV的抑制作用逐步下降,PRRSV滴度逐渐增高。上述结果表明rPoIFN-α对PRRSV有较好的抑制活性,可有效抑制PRRSV的增殖,为开展rPoIFN-α的动物实验提供参考依据。4.重组猪α干扰素猪体抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染研究为评价rPoIFN-α在猪体内对PRRSV预防和治疗效果。首先将PRRSV阴性仔猪人工感染高致病性蓝耳病毒(HP-PRRSV),然后分别于攻毒同时、攻毒后1 d和出现症状后用rPoIFN-α进行处理,连续3天。结果显示,攻毒的同时用干扰素处理组和攻毒后第一天用干扰素处理组PRRSV在早期增殖延缓,血清阳转水平延缓。出现症状后用干扰素处理组在第一天注射干扰素后,相对不治疗攻毒对照组,血液中病毒含量降低,体温升高现象改善;连续3天注射后,血液中病毒含量显著低于阳性对照组。证明rPoIFN-α能在猪体内抑制HP-PRRSV感染,具有重要应用前景。