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研究目的:癫痫(epilepsy,EP)作为神经系统常见疾患之一,尽管多数经抗癫痫药物(anti-eipleptic drugs,ADEs)治疗可缓解,但仍有约30%的患者药物治疗无效,成为难治性癫痫(intractable epilepsy,IE),其中成年IE中最常见的类型是颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)。参与癫痫的发病机制较为复杂,目前仍不能明确,但大多与神经胶质细胞活化增生、神经递质的异常分泌、离子通道、遗传等因素密切相关。不断寻找癫痫治疗的有效靶点一直是目前癫痫研究工作的重点。腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)作为神经炎症的关键上游触发因子,在脑缺氧、脑缺血、脑外伤或癫痫发作等病理条件下,浓度急剧升高,激活P2X受体,从而产生一系列与癫痫相关的生物学变化。有文献指出,在癫痫患者以及癫痫动物模型中,观察到P2X受体的不同亚型均有异常变化,提示了其在癫痫发生发展中的作用。近几年对癫痫诊治的研究已逐渐由蛋白分子水平转移至核酸水平,从核酸水平入手,研究调控癫痫介导炎症反应的相关机制,从而达到靶向治疗的目的。MicroRNAs(miRNAs)作为体内的一种非编码调控基因,在调控癫痫的发生、发展过程中发挥着重要作用,广泛参与各种生理活动的调控,包括炎症反应、突触重建、细胞凋亡、神经胶质细胞活化增生等,已在肿瘤等领域广泛应用。其中miRNA-22主要参与炎性反应,能够靶向作用于P2X7受体,调控NF-κB、IL-1β等炎性介质,而这些炎性介质可通过对神经元的多种直接或间接作用参与癫痫形成过程,这使应用miRNA-22治疗癫痫成为可能。本实验通过转染miRNA-22的类似物miRNA-22 agomir致癫痫大鼠脑内,上调致痫灶(epileptogenic zone,EZ)内miRNA-22的表达,探索其能否靶向性的调控下游的目的蛋白P2X7,紧跟当前国际研究热点,从核酸水平上进一步探讨难治性癫痫新的治疗策略,并探讨经侧脑室单次注射miRNA-22agomir治疗颞叶癫痫起效的最佳浓度。研究方法:本实验采用氯化锂-匹罗卡品诱导颞叶癫痫模型,实验共分成两个部分,第一部分:选取造模成功3天后的急性期颞叶癫痫大鼠20只,并使用相同数量随机选择的正常大鼠作为对照组,应用Western-blot,qRT-PCR检测P2X7,NF-κB和IL-1β的表达情况,行免疫荧光观察P2X7在致痫灶组织中的分布情况和星形胶质细胞增生情况,行尼氏染色观察海马神经元损伤情况。之后随机选取造模成功3天后的急性期颞叶癫痫大鼠40只,按照随机原则分成两组,分别经侧脑室给予等量的miRNA-22 agomir及miRNA-22 agomir control试剂,应用Western-blot,qRT-PCR检测P2X7,NF-κB和IL-1β的表达情况,行免疫荧光观察P2X7在致痫灶组织中的分布情况和星形胶质细胞增生情况,行尼氏染色观察海马神经元损伤情况,探讨miRNA-22通过下调P2X7在急性颞叶癫痫大鼠中的潜在治疗价值。第二部分:将0.1mM,2.5mM,5mM,10mM,20mM不同浓度的miRNA-22 agomir试剂经侧脑室注射,于注射后第3天,断头取脑,应用Western-blot,qRT-PCR检测P2X7的表达情况,探讨经侧脑室单次注射miRNA-22 agomir治疗颞叶癫痫的最佳起效浓度。研究结果:1、SD大鼠经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品可诱导出典型的颞叶癫痫持续状态。实验大鼠一开始表现为嘴角流涎、双眼充血等反应,而后出现反复点头、行动刻板、面部抽动、湿狗样抖动,直至最终出现全身强直-阵挛癫痫大发作。第一部分:造模成功率88%(总共75只大鼠,其中69只成功建立急性期颞叶癫痫模型,随后死亡3只,总共存活66只),在造模成功的癫痫大鼠中,随机选择60只,平均分成3组,每组20只,其中一组为癫痫组,用于和正常大鼠做对比,另两组分别经侧脑室给予相同剂量的miRNA-22 agomir和miRNA-22agomir control试剂。第二部分:造模成功率为89%(总共75只大鼠,其中67只成功建立急性期颞叶癫痫模型,后死亡4只,总共存63只),按照随机原则,选择60只癫痫大鼠,分成6组,用于探讨miRNA-22 agomir在急性颞叶癫痫治疗中的最佳起效浓度。2、Western-blot结果显示:第一部分:与正常组相比,癫痫组大鼠致痫灶内P2X7蛋白水平的表达是增高的;经侧脑室注射miRNA-22 agomir后,检测到P2X7的表达较miRNA-22 agomir control组有明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。第二部分:各实验组内P2X7蛋白表达水平有不同程度的降低,与阴性对照组相比,差异有显著性(P<0.05),各实验亚组内可见注射2.5mM,5mM,10mM这三个浓度的大鼠海马组织内P2X7蛋白表达水平明显降低,其中注射2.5mM与注射10mM的P2X7蛋白表达水平最低,两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3、qRT-PCR结果显示:第一部分:与正常组相比,癫痫组大鼠致痫灶内miRNA-22、P2X7mRNA、NF-κBmRNA和IL-1βmRNA的水平是增高的,差异具有统计学意义(P<0.05);侧脑室注射miRNA-22 agomir后,检测到miRNA-22的表达是增高的,P2X7mRNA、NF-κBmRNA、IL-1βmRNA的表达较miRNA-22agomir control组是降低的,有明显差异(P<0.05)。第二部分:各实验组内P2X7mRNA表达水平明显降低,与对照组相比,差异有显著性(P<0.05),各实验亚组内可见注射2.5mM,5mM,10mM这三个浓度的大鼠海马组织内P2X7mRNA表达水平明显降低,其中注射2.5mM与注射10mM的P2X7mRNA表达水平最低,两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4、尼氏染色结果显示:在癫痫组大鼠海马CA3区,镜下能够观察到神经元的形态异常,呈不规则改变,具体表现为体积变小,胞核与胞浆之间的分界模糊,尼氏小体解体,数量明显减少,与正常组大鼠相比,差异有统计学意义(P<0.05);侧脑室注射miRNA-22 agomir后,检测到神经元形态异常、缺失、尼氏小体解体等情况较miRNA-22 agomir control组有明显改善。5、免疫荧光结果显示:癫痫组大鼠海马组织内可见较多的P2X7分布以及大量异常增生的星形胶质细胞,与正常组大鼠相比较,差异有统计学意义(P<0.05);侧脑室注射miRNA-22 agomir后,P2X7分布较miRNA-22 agomir control组明显减少,另外可见星形胶质细胞增生活化情况有所改善,且差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论:1、癫痫大鼠体内P2X7的水平较正常大鼠是增高的,表明了其在癫痫中的潜在研究价值;同时,癫痫发作后,观察到癫痫大鼠海马组织中星形胶质细胞的异常活化增生,NF-κB和IL-1β等炎症因子的表达上调。2、侧脑室注射了miRNA-22 agomir后观察到癫痫大鼠体内P2X7的表达量下调,星形胶质细胞活化增生情况得到改善,NF-κB和IL-1β等炎症因子的表达下调,表明了miRNA-22 agomir能够通过下调其下游的靶蛋白,降低炎症因子的表达,从而达到抑制癫痫发作的目的。3、经侧脑室单次注射miRNA-22 agomir至癫痫大鼠海马组织中有一个最佳起效浓度。4、在核酸水平上,以miRNA-22为干预靶点可以为未来癫痫提供治疗的新方向。