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人星状病毒(HumanAstrovirus,HAstV)是在婴幼儿中引起病毒性腹泻和急性胃肠炎的主要病原体之一,并在免疫缺陷病人中伴随着脑炎和病毒血症。其感染既可引起爆发性腹泻,也可引起散发性腹泻。感染源为被污染的水、食物及接触到的物体等,主要通过粪口途径传播。常产生的症状为水样腹泻、呕吐、食欲减退,偶尔伴随有发热、腹痛,全球每年死于腹泻及其并发症的婴幼儿大约有210万左右。目前,国内外针对HAstV的研究主要集中于其流行病学调查、基因分型、遗传分析、临床检测等领域,而对其分子致病机制的研究却很少,更没有针对HAstV的疫苗或治疗性药物,因此对其进行研究迫在眉睫。本文选取了 HAstV非结构蛋白nsP1a水解蛋白nsP1a/1,对其生物学功能进行初步的研究。本文的研究工作主要包括三个方面:(1)HAstV非结构蛋白nsP1a/1对IFN-β的影响;(2)HAstV非结构蛋白nsP1a/1转录活性的测定;(3)HAstV非结构蛋白nsP1a/1表达纯化及多克隆抗体的制备。(1)HAstV非结构蛋白nsP1a/1对IFN-β的影响本研究通过PCR的方式扩增了 HAstV nsP1a/1基因并构建至真核表达载体pEGFP-N2和pcDNA3.1载体上,经酶切及测序鉴定重组表达载体构建正确。将重组真核表达载体nsP1a/1-pEGFP-N2和nsP1a/1-His-pcDNA3.1分别转染293T细胞,通过荧光显微镜观察(nsP1a/1-pEGFP-N2)及Western blot的方式(nsP1a/1-His-pcDNA3.1)检测了目的基因nsP1a/1的表达。随后,再次转染重组表达质粒nsP1a/1-His-pcDNA3.1至293T细胞,并使用poly(I:C)刺激细胞产生IFN-β,利用RT-PCR和Real-time qPCR的方式检测nsP1a/1是否能够抑制IFN-β的产生。结果显示nsP1a/1不能够抑制I型干扰素的产生。(2)HAstV非结构蛋白nsP1a/1转录活性的测定由于钓饵载体pGBKT7 MCS位点处没有所需的酶切位点,故通过PCR的方式对钓饵载体MCS处进行改造,并命名为pGBST7。将HAstV nsP1a/1基因构建至改造后钓饵载体pGBST7,经酶切及测序鉴定构建正确。将其电转化Y2HGold酵母感受态细胞后对其毒性及转录活性进行检测后发现其对酵母菌株Y2HGold存在转录活性,即自激活作用,说明在nsP1a/1中存在转录因子或转录活化结构域。随后通过构建删除突变体的方法鉴定出其转录活性区域位于130-522bp之间,并且通过软件对其氨基酸序列特征进行了分析,其存在转录因子特征性结构。将钓饵载体△388-522 nsP1a/1-pGBST7电转化Y2HGold酵母感受态细胞,进行酵母双杂交实验,重复3次实验,没有筛选到与其相互作用的靶蛋白。(3)HAstV非结构蛋白nsP1a/1表达纯化及多克隆抗体的制备将HAstV nsP1a/1基因构建至原核表达载体pET-28a,并在其末端构建His-tag标签便于纯化,经酶切及测序鉴定构建正确。将重组质粒nsP1a/1-His-pET-28a转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导nsP1a/1得到大量表达,并且主要以包涵体形式进行表达。使用镍柱亲和层析纯化目的蛋白,免疫SD大鼠,制备了 nsP1a/1多克隆抗体,间接ELISA测定多克隆抗体血清效价高达1:256000,通过Western blot鉴定多抗血清具有良好的特异性。本论文初步探索了 HAstV nsP1a/1的生物学特性,证实了 HAstV nsP1a/1不能够抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素信号通路,但是发现其具有转录活化功能,并鉴定出其转录活性区域位于130-522bp之间,且成功制备了 HAstV nsP1a/1多克隆抗体,不仅为后期对HAstV nsP1a/1进行深入研究奠定了基础,而且为后续进一步探索HAstV分子致病机制拓展了新的思路。