第一部分非致残性缺血性脑血管事件患者循环内皮祖细胞功能变化的研究背景:短暂性脑缺血发作(Transient ischemic attack,TIA)和轻型卒中都属于非致残性缺血性脑血管事件(Non-disabling ischemic cerebrovascular events,NICE),它们占缺血性脑血管病的比例约40%,TIA和轻型卒中90天的复发率可达20%,其中近一半的复发卒中患者可出现了功能残疾或死亡。内皮功能障碍是动脉粥样硬化的原因,缺血性脑血管病的常见原因为动脉粥样硬化。虽然成熟血管内皮细胞在内皮修复方面有一定作用,但它们的再生能力有限。所以血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)在血管内皮修复中的作用受到越来越多的关注。EPCs是一种可分化为血管内皮细胞的干细胞。脑梗死的严重程度与循环EPCs数量有直接联系,梗死体积大与外周血EPCs数量减少有相关性。与正常人群比较,循环EPCs在患动脉粥样硬化人群中的数量较少,细胞迁移、增殖能力低于正常组。而循环EPCs数量较少的人群更容易并发动脉粥样硬化。不难理解,各种动脉粥样硬化危险因素都最终影响EPCs数量和功能,而EPCs数量和功能直接影响血管内皮的修复能力。神经内科临床工作中,常常会遇见由TIA和轻型卒中发展而来的进展性卒中患者,推测NICE人群中,其循环EPCs的功能(增殖、分化、迁移能力)可能存在差异,这些差异可能导致部分NICE患者发展为脑梗死。目前,EPCs与NICE的关系较少有报道,因此本研究部分围绕NICE患者循环EPCs的功能进行研究。目的:通过对NICE、脑梗死、正常人群循环EPCs的黏附能力、增殖能力、迁移能力的比较,探讨循环EPCs的功能差异对非致残性缺血性脑血管事件的影响。方法:连续收集发病24h以内的NICE患者30例,按照高危非致残性缺血性脑血管事件(High-risk non-disabling ischemic cerebrovascular events,HR-NICE)评估标准,把存在下列情况之一者认为是HR-NICE,包括:(1)高危TIA(ABCD2≥4分);(2)轻型卒中;(3)急性多发性脑梗死;(4)颅内外动脉狭窄率大于50%。其中,HR-NICE组15例,非高危非致残性缺血性脑血管事件(Non-high-risk non-disabling ischemic cerebrovascular events,NHR-NICE)组15例。同时,选同期急性脑梗死(Acute cerebral infarction)患者和健康志愿者各15例,分为脑梗死组(ACI组)和正常对照(Normal control,NC)组。密度梯度离心法分离外周血EPCs,Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acetylated low density lipoprotein,Dil-acLDL)和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素(Fluorescein isothiocyanate labed ulex europaeusagglutinin-lectin,FITC-UEA-Lectin)双吞噬实验鉴定EPCs,MTT法测各组外周血EPCs增殖能力,Boyden小室测EPCs迁移能力。结果:1.密度梯度离心法分离出来的细胞,经培养24h为散落的小圆形细胞,培养72h可观察到细胞变大,细胞集落出现,周边细胞呈放射状生长。Dil-acLDL/FITC-UEA-Lectin双吞噬实验鉴定该细胞群为EPCs细胞;2.EPCs黏附能力检测结果显示:与NC组比较,HR-NICE组、NHR-NICE组、ACI组EPCs细胞黏附能力减弱,ACI组细胞黏附能力最差,与NHR-NICE组比较,HR-NICE组细胞黏附能力减弱(P<0.05);3.EPCs迁移能力检测结果显示:NHR-NICE组、HR-NICE组和ACI组细胞迁移能力较NC组减弱,HR-NICE组次之,ACI组最差。NHR-NICE组与HR-NICE组比较,HR-NICE组细胞迁移能力更差(P<0.05);4.EPCs增殖能力检测结果显示:与NC组比较,HR-NICE组、NHR-NICE组和ACI组细胞增殖能力减弱,ACI最差;与NHR-NICE组比较,HR-NICE组细胞增殖能力下降(P<0.01)。结论:1.经形态学及细胞双吞噬实验鉴定,由密度梯度离心法分离的细胞为EPCs;2.循环EPCs的功能下降,可能导致NICE转换为HR-NICE;第二部分内皮祖细胞对非致残缺血性脑血管事件病情评估的研究背景:NICE在短期内可复发成为严重的脑血管事件,称为HR-NICE,它包括ABCD2大于或等于4分的TIA、轻型卒中、急性多发性脑梗死、狭窄率大于50%的颅内或者颅外大动脉粥样硬化患者。TIA和轻型卒中有较高的复发风险,因此研究者们制定了一些预测该类患者卒中复发风险的指标。包括临床预测因素(如ABCD2、加利福尼亚风险评估等评分量表)、影像预测因素(新发梗死病灶和动脉狭窄率)、生物标记物预测因素(如糖化白蛋白、超敏C反应蛋白)。值得注意的是,评估工具里涉及的生物预测因素均为血管损伤指标,没有提出关于血管修复的生物标记物。卒中发生后,为评估患者远期预后,针对血管损伤和修复,更关注的是血管修复能力的强弱。EPCs具有改善内皮功能障碍,促进血管发生的成血管作用。EPCs的动员及归巢受到一些细胞因子的促进作用,包括:基质细胞衍生因子-1α(Stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α),血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)、血小板衍生生长因子-BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)等。最为明确的是SDF-1α及其受体促进EPCs的释放和归巢,结合EPCs和SDF-1α为促进血管修复的因素,推测NICE人群中,其循环EPCs数量及血浆SDF-1α水平可能存在差异,这些差异可能导致部分NICE患者反复发作,甚至发展为脑梗死,而这一类患者可能就是HR-NICE人群。EPCs和SDF-1α可能作为一种新的生物学指标,预测NICE是否发展为HR-NICE的风险评估指标。目的:探讨NICE患者循环EPCs数量及血浆SDF-1α浓度是否可作为高危非致残缺血性脑血管事件(HR-NICE)的早期风险评估指标。方法:1.根据纳入标准,连续收集2016年1月至2018年6月在重庆医科大学附属永川医院神经内科就诊的NICE患者153名,按照HR-NICE评估标准,将他们分为HR-NICE组和NHR-NICE组,另选取15名健康志愿者。采集患者人口学特征、病史资料、美国国立卫生研究院卒中量表(National institute of health stroke scale,NIHSS)评分、ABCD2评分、改良Rankin量表(Modified rankin scale,mR S)评分;2.收集入组病例入院血常规、肝肾功能、心酶、甘油三酯(Triglycerides,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)、同型半胱氨酸(Homocysteine,HCY)、血糖、心电图、头颅MRI、MRA或CTA等;3.采用流式细胞法检测循环CD34+/VEGFR2+EPCs;4.采用ELISA法检测血清SDF-1α、VEGF、FGF、PDGF-BB;5.将脑梗死危险因素及EPCs、SDF-1α、VEGF、FGF、PDGF-BB纳入单因素Logistic回归分析,筛选出可能有意义的变量,再进行多因素Logistic逐步回归分析,排除混杂因素,分析出哪些变量为NICE转换为HR-NICE的预测因子。结果:1.153名NICE患者中有85名男性患者,68名女性患者,平均年龄59.15岁。与NHR-NICE组比较,HR-NICE组患者年龄更大,并且患有高血压和糖尿病的患者更多(P<0.01);2.与NHR-NICE组比较,HR-NICE组患者外周血TG、TC、LDL更高(P<0.05)。而发病至抽血时间、性别、吸烟、体重指数、HCY的比较,两组之间的差异无统计学意义(P>0.05);3.与NHR-NICE组比较,HR-NICE组循环CD34+/VEGFR2+EPCs数量减少(P<0.01)。但SDF-1α、VEGF、FGF升高,两组比较,差异具有非常显著性(P<0.01)。而PDGF-BB在两组患者血浆中表达不具有统计学意义(P>0.05);4.单因素Logistic回归分析筛选出可能有意义的变量,其结果显示:年龄、高血压、糖尿病、TG、TC、LDL、CD34+/VEGFR2+EPCs、SDF-1α、VEGF、FGF与HR-NICE的发生相关(P<0.05);5.多因素Logistic回归分析,结果显示:年龄(OR:1.134,95%CI:1.030-1.249,P=0.011)、高血压(OR:10.798,95%CI:2.174-53.622,P=0.004)、糖尿病(OR:11.630,95%CI:1.487-90.941,P=0.019)、TC(OR:2.416,95%CI:0.971-6.010,P=0.058)、CD34+/VEGFR2+EPCs(OR:0.067,95%CI:0.023-0.198,P<0.01)、SDF-1α(OR:1.007,95%CI:1.003-1.011,P<0.01)。年龄、高血压、糖尿病、TC、SDF-1α为HR-NICE的危险因素,EPCs为HR-NICE保护因素。结论:1.HR-NICE患者发病年龄大,且具有更多脑血管病危险因素;2.循环CD34+/VEGFR2+EPCs数量减少可能导致NICE转化为HR-NICE。作为机体代偿机制,发病后SDF-1α、VEGF、FGF升高,并促进EPCs动员入血,促进内皮修复及血管再生;3.年龄、高血压、糖尿病、TC为HR-NICE的危险因素,CD34+/VEGFR2+EPCs为HR-NICE的保护因素,CD34+/VEGFR2+EPCs数量和SDF-1α浓度对预测NICE转化为HR-NICE有重要的临床价值;第三部分不同亚型内皮祖细胞对非致残性缺血性脑血管事件病情评估的研究背景:EPCs不能通过形态学被鉴定,在它分化成熟的不同阶段,有不同的表面标记物。EPCs存在于骨髓阶段,CD133、CD34和VEGFR2表面抗原阳性。EPCs动员入血之后,CD133表达逐渐减少,而CD34、VEGFR2仍然有表达。此后,在EPCs成熟过程中,CD34的表达也逐渐减少,但VEGFR-2仍为阳性。因此,EPCs为一个不同亚型细胞并存的细胞群。目前认为,CD34+/VEGFR2+细胞被认为是EPCs,本研究团队既往将荧光VEGFR2抗体标记骨髓EPCs用于流式细胞的检测。既然CD34+/VEGFR2+细胞作为EPCs群的一种存在状态用于流式细胞检测,并由此推测出循环EPCs数量,那么VEFDR2+细胞是否也能作为EPCs的一种存在状态并代表循环EPCs数量可用于流式细胞检测。在本实验中,我们根据VEGFR2+细胞与CD34+/VEGFR2+细胞表达差异,探讨另外一种可能应用于临床的检测循环EPCs的方法。同时,探讨VEGFR2+EPCs是否也可作为HR-NICE的早期风险评估指标。目的:探讨VEGFR2+EPCs是否可作为HR-NICE的早期风险评估指标。方法:1.根据纳入标准,连续收集2016年1月至2018年6月在重庆医科大学附属永川医院神经内科就诊的发病24小时以内的NICE患者153名,将他们分为HR-NICE组和NHR-NICE组,另选取15名健康志愿者。采集患者人口学特征、病史资料、ABCD2评分、NIHSS评分、mR S评分;2.收集入组病例入院血常规、肝肾功能、心酶、TC、TG、LDL、HCY、血糖、心电图、头颅MRI、MRA或CTA等;3.采用流式细胞法检测循环VEGFR2+EPCs和CD34+/VEGFR2+EPCs;4.单因素Logistic回归分析筛选出上述指标中可能有意义的变量,再进行多因素Logistic逐步回归分析,分析哪些变量为NICE转换为HR-NICE的预测因子。结果:1.循环VEGFR2+EPCs在HR-NICE组、NHR-NICE组、NC组的均值分别为1.93%、2.22%和1.44%,三组比较差异具有显著性(P<0.01)。但HR-NICE组与NHR-NICE组比较,差异不具有统计学意义(P=0.39);2.循环CD34+/VEGFR2+EPCs占单核细胞比值的均值在HR-NICE组、NHR-NICE组、NC组分别为4.09/000、5.75/000和3.40/000,三组比较差异具有显著性(P<0.01);与NHR-NICE组比较,HR-NICE组循环CD34+/VEGFR2+EPCs数量降低,差异具有显著性(P<0.01)。与NC组比较,HR-NICE组与NHR-NICE组循环CD34+/VEGFR2+EPCs较高,差异具有统计学意义(P<0.05);3.因HR-NICE组与NHR-NICE组循环VEGFR2+EPCs比较差异不具有统计学意义(P>0.05),因此,VEGFR2+EPCs结果不能纳入多因素回归分析。结论:1.循环CD34+/VEGFR2+EPCs数量减少,可能导致NICE转换为HR-NICE;2.循环VEGFR2+EPCs在HR-NICE组降低,但不能作为NICE是否转换为HR-NICE的预测指标。