骨质疏松症是以骨微细结构破坏和骨量减少为特征的全身性骨代谢疾病,可导致骨脆性和骨折风险性增加。在骨代谢中,过量ROS引起破骨细胞骨吸收增加,成骨细胞骨形成减少,骨代谢的平衡被破坏,造成骨量丢失、骨质疏松的发生。中药仙茅来源于石蒜科植物仙茅(Curculigo orchioides Gaertn,CG)的干燥根茎,能够强筋骨、抗衰老、益精血,是著名的补肾中药。仙茅苷为仙茅中主要活性成分,具有抗氧化、增强免疫、抗骨质疏松、抗抑郁和神经保护等多种生物活性。课题组前期研究采用活性炭处理的血清和无酚红培养基建立的成骨细胞模型,发现仙茅苷无明显的雌激素样作用；通过复制小鼠铁超载氧化应激模型,发现仙茅苷能够有效提高铁超载小鼠的骨密度,调节骨代谢相关蛋白的表达,表明仙茅苷能够保护氧化应激状态下的骨组织,但作用机制尚不清楚。另一方面,仙茅苷属于苯甲酸酯类酚苷,口服绝对生物利用度较低,仙茅苷的体内药效物质基础有待阐明。因此,本课题研究了仙茅苷保护氧化损伤成骨细胞的作用机制,并明确了仙茅苷在大鼠体内的代谢产物：本课题采用过氧化氢(H2O2)建立氧化损伤成骨细胞模型,明确了仙茅苷对氧化损伤成骨细胞的保护作用；通过观察仙茅苷对氧化损伤成骨细胞中FoxO1通路关键蛋白表达的影响,初步明确了仙茅苷对氧化损伤成骨细胞保护作用的机制；同时,应用LC-Q-TOF/MS的方法鉴定了仙茅苷在大鼠体内的代谢产物,解释了仙茅苷较低生物利用度的代谢机制,并观察了主要代谢产物M2对氧化损伤成骨细胞的作用,以探索仙茅昔的药效物质基础。1、仙茅苷对氧化损伤成骨细胞功能和抗氧化体系的影响采用H2O2氧化损伤成骨细胞模型,以细胞活力、碱性磷酸酶(ALP)酶活力、骨结节矿化量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活力、过氧化氢酶(CAT)酶活力、ROS水平、细胞周期和线粒体膜电势为指标,考察仙茅苷对氧化损伤成骨细胞的作用。结果显示,仙茅苷(10-8、10-7和10-6mol/L)能够显著提高氧化损伤成骨细胞的细胞细胞活力、提高ALP酶活力、促进骨结节的矿化,提高SOD和CAT酶活力、降低ROS水平,提高线粒体膜电势和减少细胞周期阻滞。2、仙茅苷保护氧化损伤成骨细胞的作用机制研究本实验采用H2O2氧化损伤成骨细胞模型,从蛋白水平研究了仙茅苷对氧化损伤成骨细胞的保护机制。Western结果表明,仙茅苷能够上调总蛋白中sod和OPG的表达并下调Rankl的表达；通过分别提取细胞核和细胞质蛋白,发现仙茅苷能够有效提高FoxO1a蛋白在细胞核/细胞质蛋白的比例,且SOD蛋白表达同时上调。荧光免疫组织化学定位实验结果表明,仙茅苷能够显著提高FoxO1a细胞核在蛋白量,继而促进细胞核中FoxO1a与ATF4因子的相互作用。3、仙茅苷在大鼠体内的代谢产物研究建立LC-Q-TOF/MS检测仙茅苷在大鼠体内代谢产物的方法,确定了仙茅苷在大鼠体内的7个代谢产物,其中M1、M2和M3为Ⅰ相代谢产物,由仙茅苷糖昔键水解或者酯键水解而成;M4、M5、M6和M7为仙茅苷在大鼠体内的Ⅱ相代谢产物,由仙茅苷、M1和M2葡萄糖醛酸化以及去甲基化而成。Ⅰ代谢相产物分布于血浆、尿液和组织中,而Ⅱ相葡萄糖醛酸接合产物分布在血浆和胆汁中。4、仙茅苷和代谢产物M2药物含量的分析通过比较发现代谢物M2相对含量最高且远远高于其他代谢产物,经定量分析发现,代谢产物M2的血药浓度远高于仙茅苷。另外,M2在重要的组织如肾、骨髓、胸腺、子宫、睾丸和大脑组织中均有分布且含量较高,推测代谢产物M2可能具有活性。5、代谢产物M2对氧化损伤成骨细胞的作用通过观察仙茅苷主要代谢物M2对氧化损伤成骨细胞的作用,发现M2可显著促进氧化损伤成骨细胞的增殖,表明代谢物M2对氧化损伤成骨细胞具有保护作用。