第一部分应用氧化比色微量稀释药敏试验方法检测念珠菌对特比萘芬的敏感性目的：了解本地区临床分离念珠菌对特比萘芬的体外敏感性及耐药状况，为临床合理用药提供参考。方法：参照美国国家临床试验室标准化委员会（NCCLS）推荐的M27-A药敏试验方案的微量稀释法，并应用氧化还原指示剂Alamar blue作为药敏实验结果指示剂，通过氧化比色法判定药物的最小抑菌浓度（MIC），检测特比萘芬对2株ATCC标准白念珠菌和129株临床分离念珠菌的MIC值。结果：特比萘芬对2株ATCC标准白念珠菌的MIC值分别为8μg／ml和2μg／ml；特比萘芬对129株临床分离的念珠菌的MIC值范围为0.0313～16μg／ml，MIC₅₀为4μg／ml，MIC₉₀为8μg／ml，其中，特比萘芬对白念珠菌的MIC值介于≤0.0313～≥16μg／ml之间，MIC₅₀为4μg／ml。MIC₉₀为8μg／ml；对热带念珠菌的MIC值介于2～≥16μg／ml之间，MIC₅₀为8μg／ml，MIC₉₀为16μg／ml；对季也蒙念珠菌的MIC值介于1～4μg／ml之间，MIC₅₀为2μg／ml，MIC₉₀为4μg／ml；对近平滑念珠菌的MIC值介于1～4μg／ml之间，MIC₅₀为2μg／ml，MIC₉₀为4μg／ml；对克柔念珠菌的MIC值介于0.5～4μg／ml之间；对葡萄牙念珠菌的MIC值介于4～≥16μg／ml之间。结论：特比萘芬对本地区临床流行的念珠菌有良好的体外抑菌作用，本地区目前尚未发现耐特比萘芬的念珠菌流行；氧化比色微量稀释药敏试验方法有较好的可重复性和稳定性，且简单省时。第二部分白念珠菌对特比萘芬耐药性的体外梯级诱导和回复研究目的：以浓度梯级倍增的特比萘芬在体外诱导白念珠菌标准株获得耐药子代菌株，并观察其耐药稳定性，从细胞水平研究白念珠菌对特比萘芬耐药前后生物学特性的变化，为进一步采用基因芯片在基因表达水平上研究特比萘芬对白念珠菌的药理作用及其诱导耐药机制提供理想的实验模型。方法：将白念珠菌ATCC90028株在特比萘芬浓度逐渐梯级倍增的YPD液体培养基中分别转种传代，直到最后转种至含1024μg／ml特比萘芬的YPD液体培养基中培养，分别测定诱导后形成的各子代菌株的MIC值；选用以1024μg／ml特比奈芬诱导形成的耐药菌株，在不含特比萘芬的YPD液体培养基中连续传代10次后，测定其MIC值，观察其耐药表型的稳定性；并分别用肉眼、光镜和电镜观察白念珠菌耐药性产生前后的形态学特征。结果：特比萘芬MIC值为8μg／ml的白念珠菌母本菌株（白念珠菌ATCC90028）成功地被诱导成特比萘芬MIC值为≥512μg／ml的子代菌株，进一步的耐药稳定性实验说明诱导后形成的子代菌株的表型是相对稳定的，诱导后的子代耐药菌株与其母本相比，其生长繁殖速度减慢，细胞形态不规则，部分细胞胞膜不完整。结论：通过在药物浓度梯级倍增的培养基中连续传代培养的方法可成功建立相同基因型的对特比萘芬敏感的白念珠菌母本和对特比萘芬耐药的子代模型，为获取有亲本的耐药白念珠菌菌株提供了一个有效的实验方法，是在基因水平研究白念珠菌对特比萘芬耐药机制的理想实验模型。第三部分应用全基因组表达谱芯片研究特比萘芬处理前后白念珠菌基因的差异性表达目的：应用白念珠菌全基因组表达谱芯片比较特比萘芬处理前后白念珠菌基因的差异性表达，分析特比萘芬处理对白念珠菌整个基因组表达谱的影响，以期在全基因组水平上研究特比萘芬对白念珠菌的抗真菌作用机制。方法：用特比萘芬处理白念珠菌ATCC90028株90min，将处理后的菌株命名为白念珠菌ATCC90028-C株，应用全基因组表达谱芯片比较白念珠菌ATCC90028和ATCC90028-C株全基因组表达谱的差异，并应用半定量RT-PCR方法对白念珠菌ATCC90028和ATCC90028-C株中部分差异表达基因的表达水平进行验证。结果：基因芯片共筛选出222个差异表达基因，与白念珠菌ATCC90028株比较，在ATCC90028-C株中有121个基因表达上调，有101个基因表达下调，半定量RT-PCR与全基因组表达谱芯片结果一致，表达上调基因包括具有药物主动外排功能的ABC类型膜转运蛋白编码基因CDR1，MFS类型膜转运蛋白编码基因AGP2、GAP6、PHO84.3eoc和HOL3，应激反应和（或）解毒作用相关基因AGP2和HOL3，麦角固醇生物合成相关基因ERG12；表达下调的包括MFS类型膜转运蛋白编码基因FCY23和VCX1等基因。结论：特比萘芬可使白念珠菌多个与应激反应和（或）解毒作用相关的基因出现差异性表达，导致多个具有药物主动外排功能的膜转运蛋白编码基因表达上调，但对白念珠菌麦角固醇生物合成通路中的关键靶酶编码基因影响不大。基因芯片筛选出的其他差异表达基因也可能与特比萘芬的抗真菌作用机制有关，值得进一步研究。第四部分应用全基因组表达谱芯片研究特比萘芬诱导白念珠菌耐药前后基因的差异性表达目的：应用白念珠菌全基因组表达谱芯片比较特比萘芬体外诱导白念珠菌产生耐药性前后基因表达谱的差异，以了解白念珠菌对特比萘芬产生耐药性的分子机制。方法：白念珠菌ATCC90028菌株在浓度逐渐倍增的特比萘芬诱导下形成耐药的白念珠菌ATCC90028-R株，应用白念珠菌全基因组表达谱芯片比较白念珠菌ATCC90028和ATCC90028-R株全基因组表达谱的差异，并应用半定量RT-PCR方法对白念珠菌ATCC90028和ATCC90028-R株中部分差异表达基因的表达水平进行验证。结果：基因芯片共筛选出109个差异表达基因，与白念珠菌ATCC90028株比较，在ATCC90028-R株中有46个基因表达上调，有63个基因表达下调，半定量RT-PCR与全基因组表达谱芯片结果一致。表达上调基因包括分子转运和解毒相关基因IPF5324和SIT1；表达下调基因包括11个蛋白质合成相关基因、7个能量生成相关基因、糖转运蛋白基因HXT5和STL1、细胞应激反应相关基因CRD2和SOD22、以及多个金属离子平衡相关基因。结论：白念珠菌对特比萘芬耐药性的产生可能与其分子转运和解毒相关基因的上调表达，以及有关蛋白质合成、能量生成、糖转运蛋白、细胞应激反应、金属离子平衡基因的下调表达密切相关，此外，基因芯片筛选出的其他差异表达基因也可能与白念珠菌对特比萘芬耐药性的产生有关，值得进一步研究。