研究背景和目的：老年认知功能障碍是常见的神经系统退行性病变,是仅次于脑血管病的最常见神经科疾病。Prince等报告的meta-分析表明,世界大多数地区60岁以上痴呆标化患病率为5%-7%,其中拉丁美洲(8.5%)最高,非洲地区(2%-4%)最低,这项研究表明,在不同种族之间,痴呆患病率可能不同。同时,Zhang等所做的meta-分析表明中国60岁以上老年人痴呆及阿尔茨海默病(AD)患病率分别为3.0%、1.9%,且此研究纳入了从1980-2010年间中国所有有关于痴呆流行病学调查的文献。藏族经历了长期的自然选择后表现出与平原人群显著不同的体质特征,成为适应高原环境的特殊表现。藏族又因其特殊的文化、生活方式、生态环境及适应高原缺氧特点而备受国内外关注。调查发现,拉萨地区脂肪肝发病率藏族高于汉族,由此我们推测其他疾病患病率在藏族中亦有可能不同于汉族人群。而目前国内针对痴呆的患病率和相关研究在藏族群体中几乎没有开展。因此本研究进行现场流行病学调查,并使用自主设计的调查问卷进行危险因素采集。不同种族之间基因存在一定差异,各民族在高原缺氧状态下具有不同的遗传背景。高原居民特有的体质特征与特有的基因有关,在西藏、青海和云南不同藏族的ATP6、ATP8和Cytb基因比较研究中发现,ATP6基因频率可能存在适应性选择并随海拔高度增高,呈现出选择性增强趋势。西藏人口(Sherpa地区)eNOS的两个位点频率比低海拔地区高,在与缺氧有关的2个基因EPAS1和EGLN1选择性扫描中发现了强信号,这两个基因与非藏族的低海拔地区人群(汉族与日本人)明显不同。因此我们怀疑与老年痴呆发病相关的基因位点中藏族亦有可能与其他种族不同,本研究选取rs1113600等13个位点进行病例对照研究。方法：1.2014年5月至9月,研究组在青海省60岁以上的藏族老年人中进行多阶段整群随机抽样流行病学调查。第一步,在青海省随机抽取4个藏族聚集较多的市。第二步,在4个市中随机抽取6个县。第三步,在6个县中随机抽取65个藏族村。在调查人群选择过程中,所有入选人群都必须是60岁以上且有人口资料显示在本地至少居住10年以上的藏族人(n=4506),不在村中而在敬老院居住的老人研究小组同样进行了走访。为了保证最大的调查参与率,在一些交通不便的牧区进行了上门走访。但对于拒绝参与筛查、死亡、无法找到以及患有危急重症的村民没有纳入。每个调查小组针对被筛查对象及其陪护人进行访问,整个访问过程持续0.5-1个小时,主要用于采集病人详细的个人资料、既往史、家族史、现病史及主要生活习惯、情绪变化。同时,对病人进行系列神经心理学测试和神经系统体格检查,并根据测试结果和医生经验对病人病情进行判断。神经心理学测试采用简易精神量表(MMSE)、日常生活能力量表(ADL)、汉密尔顿抑郁量表进行,对于AD的鉴别诊断参考海金斯缺血量表进行。所有病人信息采集之后于当天明确诊断,当发生争议时,由专家组对病人进行再次随访,以明确诊断。痴呆的诊断依照DSM-4标准,AD以NINCDS-ADRDA标准进行诊断,血管性痴呆诊断标准依照NINDS-AIREN标准进行。其他类型痴呆因诊断标准太多,且发病率较低,本次研究暂未纳入。2.患病率分年龄、性别计算并依据2010年第六次全国人口普查数据进行标准化,人口资料和危险因素分析使用SAS16.0和spss20.0进行分析,针对已采集到的数据进行数据筛选剔除,采用卡方检验获得AD组和非AD组病人差异。针对有差异因素进行病例对照实验分析危险因素,根据病人长居的调查地区,按照1：10的比例从原始数据中随机筛选出未出现认知损伤的健康人数据,进行Logistic回归获得藏族AD患病非遗传性危险因素。由于血管性痴呆病人仅有8人,故而在后续数据分析中予以剔除。3.基因多态性分析采用病例对照研究方法,通过现场调查筛选和招募,按病例组年龄、性别进行1：1.5配比。共收集散发性AD患者外周血标本39例、健康对照者外周血标本56例,统计学检测两组性别年龄无差异,具有可比性。入组对象空腹8小时以上,抽取5ml外周静脉血于EDTA-K2抗凝管中,按照人血液DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA,然后采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight, MALDI-TOF)进行分型检测。检测位点通过查阅既往文献及参阅全基因组关联研究成果获得,Hardy-Weinberg遗传平衡、位点间连锁不平衡性、单体型及基因多态性分析使用SHEsis软件进行。所有数据分析结果以P<0.05认定为存在统计学差异。结果：1.参与数据分析的共有3982名藏族60岁以上老人,参与率达到88.37%。患有痴呆、血管性痴呆和AD的人数分别为61人、8人和53人。2.60岁以上藏族老年人痴呆患病率为1.53%(95%CI,1.15-1.92),AD患病率为1.33%(95%CI,0.98-1.69)。其中AD女性患病率为1.59%(95%CI,1.10-2.09),男性患病率为0.92%(95%CI,0.44-1.39),女性高于男性。自60岁至85岁,按照每5年一个年龄段进行分层,发现各年龄段中85岁以上年龄段患病率最高,痴呆和AD患病率均为12.05%(95%CI,7.10-17.00)。3.剔除血管性痴呆病人后,针对AD病人进行人口资料分析。发现年龄、婚姻状况、出生地、生活伴侣、饮酒、抽烟、磕长头、念经、拨念珠、转经桶,牛肉、羊肉、奶制品、豆制品、鸡肉、鱼肉及鸡蛋的摄入习惯,慢性阻塞性肺疾病病史及头部外伤史,在患病组和非患病组之间均存在组间差异。接下来进行病例对照研究分析危险因素,单因素分析发现,年龄在75-79岁(OR,4.497；95%CI,1.691-12.487)、80-84岁(OR,4.583；95%CI,1.427-14.719)、≥85岁(OR,38.500；95%CI,12.630-117.356),牛肉(OR,2.162；95%CI,1.099-4.252)、羊肉(OR,2.464；95%CI,1.165-5.211)及奶制品(OR,2.212；95%CI,1.075-4.549)摄入,慢性阻塞性肺疾病(OR,11.070；95%CI,1.805-67.874)及头部外伤史(OR,14.510；95%CI,1.293-162.889)与AD患病呈正相关；吸烟(OR,0.195；95%CI,0.046-0.824)、磕长头(OR,0.095；95%CI,0.029-0.309)、念经(OR,0.279；95%CI,0.155-0.503)、拨念珠(OR,0.331；95%CI,0.184-0.595)、转经筒(OR,0.511；95%CI,0.275-0.951)、鸡肉(OR,0.079；95%CI,0.011-0.580)及鸡蛋(OR,0.231；95%CI,0.081-0.658)摄入习惯与AD患病呈负相关。针对单因素分析中获得的患病关联因素进行多因素回归分析发现,年龄在75-79岁(OR,4.497；95%CI,1.691-12.487)、80-84岁(OR,4.583；95%CI,1.427-14.719)、≥85岁(OR,35.728；95%CI,9.640-132.418),牛肉(OR,6.174；95%CI,2.460-15.492)、头部外伤史(OR,44.622；95%CI,2.546-782.170)与AD患病呈正相关：磕长头(OR,0.109；95%CI,0.027-0.439)、拨念珠(OR, 0.198；95%CI,0.084-0.467)、鸡肉(OR,0.050；95%CI,0.005-0.520)摄入习惯与AD患病呈负相关。4.病例对照研究进行基因多态性分析。(1)病例组和对照组经统计学分析年龄性别无差异。(2)rsl1136000等13个位点的基因型在选取的研究对象中均符合Hardy-Weinberg遗传平衡,说明研究对象有良好的群体代表性。(3)连锁不平衡性分析表明CLU基因rs11136000和rs2279590位点可以相互替代,不可进行单体型分析。CLU基因rs2279590和rs9331888位点、rs11136000和rs9331888位点,TP53INP1基因rs1713669和rs4735333、rs896855位点,TFAM基因rs1937和rs2306604位点存在连锁不平衡,可以进行单体型分析。(4)基因型和等位基因频率分析表明,在不考虑APOE ε 4基因影响时,rs2279590(P=0.007)和rs11136000(P=0.022)位点等位基因频率在两组中有差异。其中rs2279590位点等位基因A(OR,3.189；95%CI,1.339-7.596)在AD组中频率更高,表现为AD患病的危险因素；rs11136000位点等位基因C(OR,0.380；95%CI,0.162-0.890)在对照组出现频率更高,表现为AD患病的保护因素。基因型频率分析中,rs2279590(P=0.025)位点在两组中有差异。APOE基因分型后,ε4频率(P=0.876)在两组间无差异,在APOEε4(+)的研究对象中,11个位点等位基因和基因型频率在病例组和对照组间均未表现出显著差异,但在APOEε4(-)的研究对象中,rs11136000(P=0.022)、rs2279590(P=0.006)和rs2306604(P=0.046)等位基因频率有差异,其中rs2279590位点等位基因A(OR,3.567；95%CI,1.397-9.111)、rs2306604位点等位基因C(OR,2.005；95%CI,1.009-3.984)在AD组中频率更高,均表现为AD患病的危险因素；rs11136000位点等位基因C(OR,0.350；95%CI,0.140-0.878)在对照组出现频率更高,表现为AD患病的保护因素。基因型频率分析中,rs2279590(P=0.022)位点在两组中有差异,余位点未表现出明显差异,将不同基因型组合进行模型分析发现,rs2279590(P=0.016)AA+GA(OR,3.264；95%CI,1.248-8.538)型相对于GG型是疾病发生的危险因素；rs9331888(P=0.045)GC(OR,0.422；95%CI,0.182-0.980)型相对于CC+GG型是疾病发生的保护因素；rs9331888(P=0.042)GG+GC(OR,0.373；95%CI,0.144-0.963)型相对于CC型是疾病发生的保护因素。(5)针对CLU基因rs2279590和rs9331888位点、rs1 1136000和rs9331888位点,TP53INP1基因rs1713669和rs4735333、rs896855位点,TFAM基因rs1937和rs2306604位点进行单体型分析发现。CLU基因rs2279590和rs9331888位点单体型AG(P=0.024)在两组间存在显著差异,AD组频率更高,表现为AD的危险因素(OR,2.721；95%CI,1.113-6.651),单体型GG(P=0.011)在两组间存在显著差异,对照组频率更高,表现为AD的保护因素(OR,0.438；95%CI,0.230-0.832)；APOE￡4(+)各单体型间未见显著差异,APOEε4(-)单体型AG(P=0.025)表现为危险因素(OR,2.918；95%CI,1.111-7.659),单体型GG(P=0.006)表现为AD的保护因素(OR,0.338；95%CI,0.152-0.750)。CLU基因rs11136000和rs9331888位点单体型TG(P=0.015)在两组间存在显著差异,AD组频率更高,表现为AD的危险因素(OR,2.815；95%CI,1.199-6.608),单体型CG(P=0.005)在两组间存在显著差异,对照组频率更高,表现为AD的保护因素(OR,0.398；95%CI,0.206-0.768)；APOEε4(+)各单体型间未见显著差异,APOEε4(-)单体型TG(P=0.016)表现为危险因素(OR,2.996；95%CI,1.193-7.521),单体型CG(P=0.003)表现为AD的保护因素(OR,0.291；95%CI,0.126-0.672)。TP53INP1基因rs1713669和rs4735333、rs896855位点各单体型在AD组和对照组间均无差异,APOE￡4(+)、APOE￡4(-)研究对象在各单体型亦未见显著差异。TFAM基因rs1937和rs2306604位点各单体型件无差异, APOE￡4(+)各单体型亦未见显著差异,但APOEε4(-)单体型GT(P=0.046)表现为AD的保护因素(OR,0.499；95%CI,0.251-0.991、。5.将基因型分析存在组间差异的基因位点数据与已得出的非遗传性危险因素磕长头、拨念珠、牛肉及鸡肉摄入习惯、头部外伤史一起进行logistic回归分析。因头部外伤史在病例组只有2例,无法进行logistic回归分析,予以剔除。结果显示rs2279590(P=0.040)AA+GA(OR,4.483；95%CI,1.069-18.792)型相对于GG型与疾病发生呈正相关。rs9331888(P=0.035)GG+GC(OR,0.184；95%CI,0.038-0.888)型相对于CC型与疾病发生呈负相关。磕长头(P=0.035,OR,0.203；95%CI,0.046-0.896)相对于不磕长头与疾病发生呈负相关。讨论：(2014年世界阿尔茨海默病报告：关键点》指出超过500万的美国人患有这一疾病,平均3个老年人中有1个带着AD或其他类型痴呆死去,每年大约有50万人因为患有AD而死去。2014年美国阿尔茨海默病协会发布的报告称,65岁时女性患AD的评估风险为1/6,约为乳腺癌的两倍。同时女性患AD的风险高于男性,65岁时男性患AD的评估风险约为1/11。2000年至2010年间,AD作为死亡原因上升为68%。据估计到2025年,65岁及以上患有这种疾病的人群将达到710万——与目前的患病人数500万相比将增加40%以上。美国有1/9的老年人患有AD,其中年龄低于65岁的占4%,年龄在65-74岁的占15%,75-84岁的占44%,85岁及以上的占38%。2014年医疗保险和医疗补助预计向患有AD和其他类型痴呆患者提供1500亿美元的医疗保健、长期护理和临终关怀费藏族由于长期生活在高原上,且有其独特的生活习惯和宗教习俗,既往研究发现2008年甘肃省甘南藏族自治州藏族人群高脂血症患病率高达26.1%,而针对痴呆目前国内外尚无关于藏族的报道,通过使用国际认可的筛查诊断流程获得藏族痴呆患病率及危险因素,可能为痴呆及AD的预防提供新的思路与方法。在中国,60岁以上老人痴呆和AD患病率为3.0%和1.9%。在本次调查中,研究发现藏族老年人痴呆和AD患病率为1.53%、1.33%,依据2010中国人口普查年龄分布标化后的患病率分别为0.20%、0.18%。藏族老年人痴呆和AD患病率明显低于国内其他已有报道人群,且AD为藏族人群中最常见的痴呆类型。由于高龄是AD最大的危险因素,根据《中国统计年鉴2014》可以看到,青海省人均预期寿命为69.96岁,山西省人均预期寿命为74.92,最近的一项研究发现,山西省60岁以上老年痴呆患病率为3.7%,因此猜测患病率较低可能是因为预期寿命较短导致藏族人群未达到发病年龄已死亡。但同时,既往研究同样指出,只有高龄一个因素并不足以导致AD的发生,且本研究数据表明80岁以上藏族痴呆患病率为5.07%,而该研究中80岁以上山西省汉族痴呆患病率为13.6%,且山西省为传统汉族聚居,地处平原,居民多从事农耕及煤炭行业,生活行为习惯及基因多态性与长居高海拔的藏民族都有很大不同,因此我们针对此较低患病率展开下一步的危险因素分析,以明确藏族AD患病危险因素。同样要提出的是,本次研究只发现了8名血管性痴呆病人,原因可能是西部农村及牧区落后不便的医疗条件导致脑卒中病人无法及时得到救治而大量死亡,考虑到此较小的样本量可能无法代表整个藏族血管性痴呆人群的特征,在后续数据分析中予以剔除。在针对非遗传性因素进行的病例对照研究中发现,年龄、婚姻状况、出生地、生活伴侣、饮酒、抽烟、磕长头、念经、拨念珠、转经桶,牛肉、羊肉、奶制品、豆制品、鸡肉、鱼肉及鸡蛋的摄入习惯,慢性阻塞性肺疾病病史及头部外伤史,在两组之间均存在差异。而文化程度、常居地、高血压病史、脑卒中病史在两者间无差异,而既往研究认为文化程度会增加大脑的的知识储备,加强了大脑神经元之间的联系,在AD发病初期,可以通过神经元间的联系代偿弥补AD所带来的认知降低；同时,文化程度影响人本身参与社会交往、社会行为的能力和程度,文化程度越高,参与社交越广泛,则越不容易患病,而此处表现出没有差异,我们猜测这可能与牧区人口分散不便接受义务教育,而导致被调查人群整体受教育程度较低有关。为排除这些差异因素对本病产生的可能影响,进一步针对数据进行单因素回归分析,我们发现在75岁之后,随着年龄增长,藏族AD的患病风险增加,这与既往研究结果一致。同时,经常摄食牛肉、羊肉及奶制品也会增加AD的患病风险,可能是因为经常食用红肉会使血液中胆固醇含量升高,进而增加心脑血管疾病的风险,而大脑的健康与心血管的正常循环供血有密切的关系,心血管系统正常运转才能保证大脑正常的氧气供应和营养供应,进而增加了本病的患病风险。慢性阻塞性肺疾病及头部外伤史也可增加患病风险,亦与既往研究保持一致。但更有意思的是,本次调查发现藏族所特有的宗教行为,磕长头、念经、拨念珠、转经筒是本病患病的保护因素,这可能是因为藏族人有虔诚的宗教信仰,这些宗教行为他们每天都要坚持进行,在一定程度上增加了精细运动和整体运动的锻炼强度,从而使大脑得到了锻炼,加强了神经元之间的联系。而摄入鸡肉和鸡蛋可以降低患病风险,则考虑藏族作为一个游牧民族,主食是牛羊肉和奶制品,尤其是牧区几乎不摄入蔬菜水果和白肉,相比较牛羊肉等红肉,鸡肉的蛋白质含量较高,脂肪含量较低,其中所含的脂类物质和牛肉、猪肉比较,含有较多的不饱和脂肪酸—油酸(单不饱和脂肪酸)和亚油酸(多不饱和脂肪酸),能够降低对人体健康不利的低密度脂蛋白胆固醇;鸡蛋黄中的卵磷脂、甘油三脂和卵黄素,对神经系统和身体发育存在有益作用,可避免老年人的智力衰退,并可改善各个年龄组的记忆力,鸡肉和蛋类等的摄入调整了饮食结构,改善了大脑的认知状况。在接下来的研究中,为了排除各个单因素之间的相互影响,我们进行了多因素回归分析,年龄在75岁以上发病风险依然随年龄增长而增加,而牛肉的摄入及头部外伤史依然是患病的危险因素,这些结果都与既往研究保持一致。鸡肉摄入同样表现为降低患病风险。宗教行为中,只有磕长头、拨念珠是本病患病的保护因素,我们考虑这是因为拨念珠是手指的精细运动,精细运动可以促进脑功能和认知的发育,可能在认知衰退的早期即可起到改善认知的作用；而磕长头是一项全身心的运动,且有虔诚宗教信仰的藏族人在进行该行为的同时也在冥想,而研究表明冥想可以诱导增加脑白质中神经髓鞘的密度,进而加强神经元之间的相互联系,同时,藏族人认为这些行为可以增进他们和佛祖之间的联系,最大程度的表达自己对佛祖的尊敬和信仰的虔诚,因此我们考虑这在一定程度上使他们的情绪得到了宣泄,心灵感到平静而不易产生抑郁倾向,而长期的抑郁本身对于认知也会产生不好的影响,因此我们认为此行为不仅锻炼了他们的身体、改善了他们的情绪、在冥想时也加强了中枢神经元对外周神经的控制,从而从多个方面改善大脑的认知功能。在与遗传因素进行结合分析后,我们得出藏族AD患者在APOE￡4基因型分布上与健康对照无差异,这与既往研究结果有所不同,这可能是因为藏族长期不与外族通婚,遗传学上属于比较封闭的群体,故而基因多态性与其他种族不同。CLU编码的聚集素在AD发病中可能会有潜在的核心作用。聚集素cDNA克隆pADHC-9在脑组织中过表达是研究发现的聚集素和AD的首个联系。CLU基因的rs2279590、rs11136000两个位点在两组之间表现出差异,与全基因组关联性研究的结果一致。但关于中国汉族人群的CLU基因多态性研究中发现,这两个位点只在未携带APOEε4的群体中表现出差异,这可能是因为汉族受到apoe基因的影响,在两者共存的时候,APOE ε 4基因在汉族AD发病中的作用更加敏感。rs9331888位点在两组间基因型频率分析中虽然未表现出差异,但其GG+GC基因型模型表现出对AD患病的保护作用,此位点位于CLU基因5’端非编码区,并不修饰直接编码的蛋白质,但却可能影响蛋白的表达水平,进而影响到疾病的易感性。TFAM基因rs2306604位点在未携带APOE￡4人群中表现出差异,可能是因为线粒体是人体细胞各种正常新陈代谢必不可少的成分,线粒体功能障碍可能导致包括老化、癌症和神经退行性疾病等一系列的病理变化。TFAM基因是线粒体类核的主要蛋白质,对维持线粒体DNA的完整性起关键作用,保护线粒体DNA免受活性氧攻击,因此我们认为TFAM可能对中枢神经有一定的保护作用。同时,线粒体单倍型B与藏族的低氧适应有关,可以使藏族更好的适应低氧环境,我们推测TFAM基因可能也与此适应有一定联系,发生突变的群体可以在大脑缺氧时更好的保护中枢神经。同时,在单体型分析中,CLU基因位点问组合的单体型依然表现出明显差异,TFAM基因单体型GT表现为保护因素。最后,将本研究已发现的差异基因位点与非遗传性影响因素结合进行回归分析后发现,CLU基因的rs2279590位点AA+GA模型是AD患病的危险因素,rs9331888位点GG+GC模型依然表现为疾病患病的保护因素。而更有意思的是,磕长头依然表现为AD患病的保护因素。而初期研究中发现的饮食因素和环境因素在最后的数据分析中并未显示出显著意义。结论：1.60岁以上藏族老年人痴呆患病率为1.53%,AD患病率为1.33%。低于目前有过报道的国内其他人群。2.藏族阿尔茨海默病与CLU基因、TFAM基因多态性有关。3.藏族虔诚的宗教行为和rs9331888位点基因多态性有益于藏族阿尔茨海默病的低患病率的发生。