生防细菌EBS05是一株樟树内生枯草芽胞杆菌,具有较强的根际定殖能力,且对多种植物病原菌具有稳定的拮抗活性,其产生的脂肽类抗生素Surfactin A是诱导烟草抗烟草花叶病毒的有效激发子,并通过激活SA信号转导途径诱导烟草产生系统抗病性,显示出良好的生防应用潜力。为了进一步明确内生细菌EBS05的生防机理,本研究采用绿色荧光蛋白基因标记技术和抗生素标记法,研究了菌株EBS05在番茄根表以及番茄体内和根际的定殖动态;以番茄品种江蔬14号为试验材料,采用RT-PCR和Real time PCR技术,研究了菌株EBS05对番茄植物的促生作用及其对番茄抗中国番茄黄化曲叶病毒的诱导抗性。结果如下:1、利用电击转化法将携带质粒gfpmut3a基因的穿梭载体pGFP4412导入菌株EBS05,获得了成功表达GFP的标记菌株EBS05-gfp。菌株EBS05-gfp可有效定殖于番茄根部表面。生物学特性检测结果表明,EBS05-gfp的生长曲线、生物膜形成能力及抗菌活性均与野生菌株一致;EBS05在番茄植株体内和根际的定殖动态测定结果表明,EBS05在番茄根、茎内均能有效定殖,其在番茄根和茎内的定殖数量均表现为接种初期逐渐增加,至接种后第14 d达到最高峰。同时,菌株EBS05具有较强的根际定殖能力,以菌体浓度为108 cfu/mL的菌悬液灌根处理后2~28 d,菌株EBS05在土壤中的定殖量始终维持在106 cfu/g·FW以上。2、通过盆栽试验,测定了菌株EBS05对番茄植物的促生作用,并初步探讨了其促生机理。结果表明,EBS05对番茄植物具有明显的促生效果。菌株EBS05可诱导番茄体内扩张蛋白基因LeEXP2、LeEXP5和LeEXP18的持续增量表达,表明EBS05可能通过诱导扩张蛋白基因的增量表达促进番茄植物生长。同时,EBS05灌根处理后,番茄根际土壤中细菌和放线菌数量显著增加,真菌数量在处理初期增加,但在处理后期明显降低,根际土壤脲酶和磷酸酶活性明显提高,表明EBS05对番茄的促生作用也可能与其改变根际土壤微生物区系,提高土壤酶活力有关。3、内生细菌EBS05能有效诱导番茄对中国番茄黄化曲叶病毒的系统抗性。EBS05诱导处理后,番茄黄化曲叶病毒病发病时间延迟,病害明显减轻,诱导抗病性效果达53.60%。4、运用RT-PCR和Real time PCR技术研究了EBS05对番茄诱导抗性的信号转导途径。结果表明,EBS05诱导处理后,番茄体内SA信号转导途径下游标记基因NPR1和PR1均在挑战接种后第1 d被激活,并持续增量表达,至第7 d时,其相对表达量达到最高峰值,分别比对照增加了16倍和13倍,由此推测,内生细菌EBS05诱导番茄对中国番茄黄化曲叶病毒的系统抗性是通过SA信号转导途径实现的。同时,在挑战接种后第5 d,JA信号转导途径下游的标记基因Coi1被激活,且增量表达,表明在EBS05诱导番茄对中国番茄黄化曲叶病毒系统抗性的信号转导途径过程中,可能存在SA信号途径和JA信号途径的交叉协同作用。5、采用RT-PCR技术研究了EBS05对番茄体内病程相关蛋白的诱导作用。结果表明,EBS05可诱导番茄体内PR1、PR2和PR3基因持续增量表达,并有效激活PR5基因的诱导表达。EBS05诱导处理后,番茄体内β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性均明显高于对照,分别于挑战接种后第7 d和第9 d达到活性峰值。6、分别采用比色法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法,测定了防卫相关酶活性及其同工酶的变化。结果表明,EBS05诱导处理后,番茄体内超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均显著高于对照健康植株,过氧化物酶(POD)活性在诱导处理后1~5 d略有下降,但是从诱导处理后第7 d起,活性迅速升高,其活性值始终显著高于对照,而EBS05诱导处理再挑战接种后,SOD、POD、PPO和PAL活性活性均明显高于对照,结合番茄黄化曲叶病毒病的病程分析,菌株EBS05诱导处理后番茄植物黄化曲叶病毒病害表现延迟和发病程度减轻与番茄体内防卫相关酶活性的提高有一定的相关性;EBS05可诱导番茄体内SOD、POD和PPO同工酶的积累量增加,并产生新的同工酶带。