氨基酸脱羧酶发酵工艺及应用研究

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本文分别对大肠杆菌(Escherichia coli)AS1.505和蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)AS1.1009的发酵条件以及L—谷氨酸脱羧酶和L—赖氨酸脱羧酶的酶学性质进行了研究。利用E.coli AS 1.505L—谷氨酸脱羧酶制备D—谷氨酸和Y—氨基丁酸,分离L—谷氨酸和L—天冬氨酸;利用H.alvei AS 1.1009L—赖氨酸脱羧酶拆分DL—赖氨酸。 D—谷氨酸是重要的医药中间体和食品添加剂,Y—氨基丁酸是中枢神经系统中有效的抑制性神经递质,D—赖氨酸可作为一种有效溶剂和手性合成纤维来合成各种药物中间体,以上产品附加值很高。目前我国氨基酸工业副产大量L—谷氨酸和L—天冬氨酸混合物,不能直接用于食品和医药工业,采用酶法分离解决了这一难题。 为获得E.coli AS 1.505菌株的最佳发酵条件,通过正交试验及培养条件优化,得出最佳培养基(g/L)配方为:葡萄糖20,蛋白胨10,玉米浆20,酵母膏2,K2HPO4l,L-谷氨酸5,pH7.2。最佳培养条件为:温度37℃,培养基装量100mL,接种量8%,发酵时间16h。 对E.coli AS 1.505菌株L-谷氨酸脱羧酶酶性质进行研究,得到制备D-谷氨酸和Y-氨基丁酸的最佳转化条件为:转化温度37℃,pH4.8,菌体浓度6g/L,吐温—800.15g/L,菌龄16h,底物浓度50g/L。L-谷氨酸脱羧酶在最适转化条件下比酶活可以达到15036U。1g湿菌体可重复使用3次共转化DL—谷氨酸25g,其中L-谷氨酸可以完全转化为Y—氨基丁酸。产物经等电点结晶法和JK008阳离子交换树脂分离。D-谷氨酸及Y—氨基丁酸的收率分别为理论收率的87%和85%。另外,还利用该酶分离制备Y—氨基丁酸(理论收率的83.4%)和L-天冬氨酸(理论收率的86.6%)。以上两种反应原料价格低廉,转化率高,工艺流程简单,适合工业化生产。 对H.alvei AS 1.1009菌株发酵条件进行研究,得出最佳培养基(g/L)配方为:蔗糖20,蛋白胨10,玉米浆20,酵母膏1,(NH4)2SO4 1,L-赖氨酸10,pH7.2。最佳培养条件为:温度35℃,培养基装量100mL,接种量6%,发酵时间14h。对L-赖氨酸脱羧酶酶性质进行了研究,结果表明:该酶最适pH为8.0,最适温度为37℃,吐温-800.5g/L,菌体浓度10g/L。最高绝对酶比活为3840U。还考察了L-赖氨酸经脱羧酶生物转化生成尸胺的反应动力学,该生物转化反应半衰期为10.58h。从D-赖氨酸添加上看,并没有出现所谓的同型底物竞争抑制作用。
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