神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是大脑或脊髓的神经细胞的结构和功能丧失导致的神经疾病,如：阿兹海默症、帕金森病、亨廷顿舞蹈症和脊髓侧索硬化症等,对人类特别是老年人的健康构成了巨大的威胁。人们试图通过化学药物治疗这些疾病,但都没有取得好的效果。于是,人们尝试通过细胞移植治疗的方法修复受损神经元。到目前为止,已经有多种细胞通过移植实验被证明对神经修复具一定作用,如多能性干细胞(PSCs)、造血干细胞(HSCs)、间充质干细胞(MSCs)、神经干细胞(NSCs)、限制性神经元前体细胞(NRPs)、特定的神经元(special neurons)等。由于多能性干细胞具有自我更新和分化为各种细胞类型的能力,然而这类细胞分化方向难以控制,直接注射到体内易形成畸胎瘤,所以并不适合直接用于临床治疗。造血干细胞、间充质干细胞和神经干细胞是成体中存在的,并且研究得最深入的三类成体干细胞。造血干细胞和间充质干细胞在一定条件下可表达神经细胞相关基因,因此临床前研究常使用这两类干细胞进行神经退行性疾病的治疗。然而,这两类干细胞在体内转分化成为神经细胞的效率非常低,对神经系统疾病的治疗作用并不十分明显。神经干细胞或神经前体细胞(NPs)为多能(mutipotent)细胞,可以分化产生神经系统两类主要的细胞：神经元(neurons)和神经胶质细胞(glial cells)。细胞移植实验发现,神经干细胞在体内更易分化成神经胶质细胞,而不是形成功能性神经元。所以NSCs的移植治疗效果也不理想。功能性神经元理论上可以用于因特定神经元损伤造成的神经系统疾病。但由于神经元属于终末分化细胞,不具有分裂增殖能力,难以获得足够用于治疗的神经元。并且,神经细胞直接移植到大脑中,其成活率和整合率都比较低,从而限制了它临床应用的可操作性。在神经系统发育过程中,存在另一个主要的细胞类型,即限制性神经元前体细胞(Neuronal restricted progenitors，NRPs)，简称神经元前体细胞。它由神经前体细胞进一步分化产生,具有一定自我更新能力和神经元系(Neuronal lineage)分化能力,在成体大脑中有迁移能力,并进一步特异地分化形成功能性神经元。NRP细胞是神经干细胞和神经元的一个过渡中间体,相比于神经干细胞,神经元前体细胞的分化能力被进一步限制,仅特异地分化为神经元,而不会分化形成胶质细胞。神经元前体细胞被认为在神经系统的自我修复过程中起着重要作用,利用其进行神经退行性疾病的治疗将更加安全有效。然而,从正常的神经组织中获取神经元前体细胞非常困难,从而阻止其在临床进一步应用。因此我们希望通过转分化技术将常见的成纤维细胞直接诱导为神经元前体细胞,从而获得大量的用于治疗的细胞。转分化技术是指在体外培养条件下,通过转基因方法将一种成体细胞类型直接诱导为另一种成体细胞类型的技术。与体细胞重编程相比,转分化技术从诱导到移植治疗的过程相对简单,所需的时间较短,且成本较低。在本课题中,我们从已知的在诱导神经元和神经干细胞过程中起着重要作用的基因中筛选出8个基因：Sox2、c-Myc、Klf4、TLX、Bmi1、BRN2、hBRN4和hFoxG1,将它们分别包装到慢病毒颗粒中,并将这些慢病毒混合在一起,感染人胎儿成纤维细胞。经过11.12天的诱导后,成纤维细胞增殖并形成紧实的细胞集落。通过不同因子组合诱导实验,我们发现这8个基因中,只需要3个因子Sox2, c-Myc加上hBRN2或hBRN4的一种,就足以诱导获得大量细胞集落。在低氧条件下,仅需7天就可以形成细胞集落。这些细胞体积小,增殖快,并且一些细胞克隆在铺有Matrigel的培养皿中可以稳定培养30代以上。经鉴定发现神经细胞标记Nestin被大量激活。在无血清神经元诱导培养基中,细胞分化形成神经元的形态,并表达神经元标记基因Tuj1。而在含血清的胶质细胞诱导培养基中,细胞并不形成GFAP阳性的胶质细胞。由此我们猜测这些细胞为为神经样特异性前体细胞(hiNRPs),而不是神经干细胞。为进一步证实这种假设,我们通过全基因表达分析证明这类细胞的基因表达模式已经完全不同于成纤维细胞。而利用反转录PCR、荧光定量PCR和免疫荧光实验鉴定发现这类细胞表达Sox2、Nestin、MS11、CD133、N-CAM、DCX、Tuj1和MAP2等神经元前体细胞的标记,也表达增殖标记基因Ki-67和趋化因子受体CXCR4,而不表达OCT4、PAX6、GFAP和NeuN,证明这些诱导获得的hiNPR细胞中不含胚胎干细胞、神经干细胞、胶质细胞和成熟神经元。体内和体外分化实验证实,hiNRPs能分化为多种特定功能性神经元,而不能分化产生星形胶质细胞和少突胶质细胞。将hiNRPs移植到老年痴呆小鼠大脑中,水迷宫实验发现hiNRPs对AD鼠的短期记忆有一定积极作用。另一方面,hiNRP细胞移植到裸鼠体内没有产生肿瘤,证明hiNRP适合应用于移植治疗。我们利用转分化技术,第一次将人成纤维细胞成功诱导为神经元前体细胞。这种快速高效且安全的方法不但可以帮助我们更深入地了解神经分化的机制,还能为临床细胞治疗神经退行性疾病提供足量和有效的细胞来源。