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严重肝脏疾病时的主要功能障碍之一,是药物在肝脏的代谢功能明显下降,从而导致药效降低,并会进一步加重肝脏损害,这主要与肝脏表达的药物代谢酶含量下降以及活性降低有关。为了解决这个问题,本研究将肝脏中较为重要的与药物代谢有关的Ⅰ相药物代谢酶—细胞色素P450 3A4(CYP 3A4)和Ⅱ相药物代谢酶—谷胱甘肽硫转移酶Al (GST A1)构建成一个双表达载体；同时,为了提高CYP3A4和GST A1的表达量,根据人类优势密码子将其基因进行优化后,构建成另一个双表达载体,分别将其转染肝脏肿瘤细胞系C3A中,以期能够增强C3A细胞的药物代谢的功能,在治疗严重肝脏疾病的病人中得到应用。1.重组质粒的构建及鉴定本实验根据人类优势密码子对CYP 3A4和GST A1序列进行优化,由Invitrogen公司进行全基因合成,并将以上两个基因克隆到以pcDNA3.1 (+)载体为骨架的双CMV启动子载体中,构建质粒pcDNA3.1 (+)-OCYP 3A4-OGST A1,以该质粒为模板扩增优化过的OGSTA1和OCYP3A4基因。从含有GSTA1和CYP 3A4的克隆中扩增GSTA1和CYP3A4基因。将获得的4个片段经酶切、连接、转化等步骤最终构建成两个双表达的重组质粒：pBudCE4.1-CYP 3A4-GST A1和pBudCE4.1-OCYP 3A4-OGST A1,序列测定及分析结果表明所构建质粒符合应用要求。2.转染肝细胞系的建立及功能评价将构建好的重组质粒pBudCE4.1-CYP 3A4-GST A1和pBudCE4.1-OCYP 3A4-OGST A1分别转染肝脏肿瘤细胞系C3A,用浓度为400μg／ml的Zeocin筛选出稳定转染的细胞系,成功构建了转染重组质粒pBudCE4.1-CYP 3A4-GST A1的细胞系,命名为C3A-未优势化；而转染重组质粒PBudCE4.1-OCYP 3A4-OGST A1的细胞虽有存活,但生长极为缓慢,至本论文完成之时仍未生长成单层细胞,目前正在进一步研究中。经MTT试验证明：CYP 3A4和／或GSTA1的表达量增加会导致细胞生长受到抑制。构建好的C3A-未优势化细胞系通过qPCR的方法检测其目的基因CYP 3A4和GST A1的表达量较正常C3A细胞系高；通过色谱法证明C3A-未优势化细胞系有明显的CYP 3A4活性,而正常C3A细胞系中CYP 3A4的表达活性较低,未检测到；用免疫组化实验证实C3A-未优势化细胞系中目的基因GST A1有表达,而正常C3A细胞系中的目的基因GST A1表达较低,未检测到；另外,C3A-未优势化细胞系对利多卡因的代谢能力亦有所增强,代谢率为62.5%,而正常C3A细胞系中的利多卡因代谢率仅为30%。结论：构建的C3A-未优势化细胞系功能有所改善,有望成为生物人工肝系统的细胞材料。