目的雄激素受体(androgen receptor,AR)在雌激素受体(estrogen receptor,ER)表达阴性(ER–)的乳腺癌中高表达,AR阳性(AR+)约占其60~70%。ER–AR+乳腺癌中AR高表达的患者预后更差,这使得AR成为一个潜在的治疗靶点。前列腺相关的ETS家族因子(prostate derived ETS factor,PDEF)特异性表达于激素相关组织上皮细胞,参与多种激素相关肿瘤的发生发展中。已有文献报道在前列腺癌中PDEF作为AR的辅调控因子参与AR信号通路,但二者在乳腺癌中具体机制仍不清楚。本研究旨在分析AR-PDEF信号通路对ER–乳腺癌的影响及相关作用机制。方法1、随机抽样ER–浸润性乳腺癌组织样本246例,免疫组织化学染色法检测AR、PDEF表达情况;统计分析均使用SPSS 20.0软件分析。分析AR和PDEF的表达情况以及二者与患者的临床病理特征之间的关系,分析AR和PDEF表达的相关性和与246例患者的预后情况。2、随机抽取15例配对癌组织和癌旁正常组织ER–乳腺癌病例,提取组织RNA进行实时定量PCR实验检测组织中PDEF mRNA的表达情况;随机抽取8例配对癌组织和癌旁正常组织ER–乳腺癌病例,提取组织蛋白进行Western blot实验检测组织中PDEF蛋白的表达情况;另外,根据AR的免疫组化情况,随机抽取7例ER–AR+病例和7例ER–AR–病例癌组织提取组织RNA进行实时定量PCR实验检测组织中AR和PDEF mRNA的表达情况,以上在组织mRNA和蛋白水平分析AR和PDEF二者之间的关系。3、选取具有ER–AR+表型的乳腺癌MDA-MB-453细胞系和SKBR-3细胞系,实时定量PCR及Western Blot实验分析雄激素二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)刺激AR活化和感染AR-shRNA慢病毒质粒下调AR后,对以上两种细胞系中PDEF mRNA和蛋白表达变化的影响;免疫荧光进一步验证在上/下调AR表达后对PDEF蛋白表达变化的影响;实时定量PCR分析不同剂量DHT分别作用MDA-MB-453和SKBR-3细胞系48 h后,AR和PDEF mRNA表达变化;免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测AR-PDEF分子复合物的形成;染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)验证AR对PDEF的调控作用。4、分别构建PDEF真核表达质粒慢病毒和PDEF-shRNA表达质粒慢病毒,感染乳腺癌细胞系SKBR-3和MDA-MB-453,Western blot和实时定量PCR验证上/下调PDEF效果;采用CCK8实验、细胞划痕实验、Transwell实验、平板克隆实验及流式细胞周期实验检测上/下调PDEF对ER–AR+乳腺癌细胞系细胞增殖、侵袭作用的影响。5、Western blot检测感染PDEF表达质粒慢病毒SKBR-3细胞系上调PDEF表达和感染PDEF-shRNA表达质粒慢病毒MDA-MB-453细胞系下调PDEF表达后,AR下游通路相关分子蛋白表达情况,分析AR-PDEF通路可能的下游分子靶点;Co-IP实验检测PDEF-MAD1分子复合物的形成;ChIP实验验证PDEF对癌基因MYC的抑制因子MAD1的调控作用。6、对ER–AR+乳腺癌细胞系SKBR-3(PDEF基础表达量较低)如下处理:感染PDEF表达质粒慢病毒(PDEF组)、同时感染PDEF表达质粒慢病毒和MAD1表达质粒慢病毒(PDEF/MAD1组)和无处理对照(Control组);通过Transwell实验、平板克隆实验、流式细胞周期实验和裸鼠体内成瘤等实验方法,进一步验证PDEF对癌基因MYC的抑制因子MAD1的调控作用。7、对ER–AR+乳腺癌细胞系MDA-MB-453(PDEF基础表达量较高)进行如下处理:感染AR-shRNA表达质粒慢病毒(AR KD组)、同时感染AR-shRNA表达质粒慢病毒和PDEF-shRNA表达质粒慢病毒组(AR KD/PDEF KD组)和无处理对照(N.S.组);通过流式细胞周期实验、平板克隆实验、细胞划痕实验、Transwell实验、CCK8和裸鼠体内成瘤等实验方法,研究与单独抑制AR相比,同时抑制AR和PDEF的表达是否更加能抑制ER–AR+乳腺癌细胞的细胞增殖和侵袭。结果1、在246例ER–乳腺癌病例中,150例(150/246,61%)显示PDEF阳性表达,168例(168/246,68%)显示AR表达阳性。PDEF表达和肿瘤分级(P=0.009)、病理学TNM分期(pTNM)(P=0.001)、淋巴结转移(P<0.009)和HER2的表达情况相关(P=0.032)并且有统计学意义。PDEF阳性表达与AR阳性表达存在正相关性(r=0.404,P<0.001)。AR阳性PDEF阳性(AR~+PDEF~+)病例与肿瘤分级(P=0.024)、pTNM分期(P=0.022)和淋巴结转移情况(P<0.001)相关且具有统计学意义。PDEF阳性表达的病例总生存和无病生存均较PDEF阴性表达的患者差,其中总生存具有统计学意义(P=0.006);总生存多因素分析发现PDEF阳性表达是其独立预后因素(P=0.028)。2、实时定量PCR法检测15例癌组织和其癌旁正常组织PDEF mRNA的表达情况发现,PDEF mRNA在ER–乳腺癌癌组织表达普遍高于癌旁正常组织,具有统计学意义。Western blot实验检测8例癌组织和癌旁正常组织PDEF蛋白的表达情况发现,PDEF蛋白癌组织表达普遍高于癌旁正常组织,具有统计学意义。实时定量PCR法检测7例ER–AR+病例和7例ER–AR–病例PDEF mRNA的表达情况结果表明,PDEF mRNA在ER–AR+组普遍高表达并且具有统计学意义。3、DHT刺激MDA-MB-453细胞系和SKBR-3细胞系后,随着AR mRNA和蛋白的表达升高,PDEF的mRNA和蛋白表达也随之升高。MDA-MB-453细胞系和SKBR-3细胞系中感染AR-shRNA慢病毒,随着AR mRNA和蛋白的表达下调PDEF的mRNA和蛋白也随之降低。相同作用时间不同作用剂量DHT刺激MDA-MB-453细胞系和SKBR-3细胞系后,随着AR mRNA表达曲线的上升,PDEF mRNA表达曲线也随AR mRNA表达曲线缓慢上升。co-IP实验检测发现AR和PDEF蛋白二者之间能形成蛋白复合物。ChIP实验结果显示,AR可结合于PDEF DNA调控PDEF基因表达上调。4、对PDEF基础表达量较低的ER–AR+乳腺癌细胞系SKBR-3感染PDEF质粒慢病毒上调PDEF的表达,感染PDEF质粒空载模板慢病毒为对照组。SKBR-3细胞的细胞功能学实验显示,上调PDEF表达SKBR-3细胞的增殖、侵袭和干性明显增加。相反,对PDEF基础表达量较高的ER–AR+乳腺癌细胞系MDA-MB-453感染PDEF-shRNA质粒慢病毒下调PDEF的表达,感染PDEF-shRNA质粒空载模板慢病毒为对照组。MDA-MB-453细胞的细胞功能实验显示,下调PDEF表达MDA-MB-453细胞的增殖、侵袭和干性明显减弱。5、SKBR-3细胞系中上调PDEF的表达后,AR蛋白表达和对照组相比无明显变化说明AR-PDEF信号通路不存在反馈环路。而癌基因MYC的表达却随之升高,MYC的抑制因子MAD1的表达却降低。MDA-MB-453细胞系中下调PDEF后癌基因MYC的表达却随之降低,MYC的抑制因子MAD1的表达却升高。Co-IP实验发现PDEF能与MAD1形成蛋白复合物。ChIP实验结果显示,PDEF可直接结合于MAD1基因的启动子区域下调MAD1基因的表达。以上实验结果显示PDEF通过抑制MYC的抑制因子MAD1的表达间接调控MYC的表达发挥促癌作用。6、三种不同处理的SKBR-3细胞功能学实验结果显示,PDEF组的细胞增殖侵袭和干性比Control组明显增强,但是当给予PDEF组的细胞MAD1上调表达时即PDEF/MAD1组,结果发现上调MAD1能明显抑制PDEF介导的细胞增殖侵袭和干性。并且裸鼠成瘤体内实验也验证了这一点,即PDEF/MAD1组的裸鼠肿瘤体积和PDEF组明显减小,裸鼠肿瘤病理切片Ki67和MYC免疫组化染色显示,PDEF/MAD1组的Ki67和MYC表达明显降低,且和PDEF组相比PDEF/MAD1组裸鼠没有发生肺转移。以上通过回复实验验证上调MAD1的表达能明显抑制PDEF介导的MYC的表达,抑制细胞的增殖和侵袭能力,同时也进一步证实PDEF是通过抑制MAD1的表达间接调控MYC的表达发挥促癌作用。7、三种不同处理的MDA-MB-453细胞功能学实验显示,抑制AR-PDEF通路即同时抑制AR和PDEF(AR KD/PDEF KD组)比单独抑制AR(AR KD组)和N.S.组相比,细胞的增殖侵袭和干性明显降低。裸鼠成瘤实验显示AR KD/PDEF KD组和其它两组相比,裸鼠肿瘤体积最小,生长曲线最缓并且Ki67和MYC表达明显降低,说明抑制AR-PDEF通路对ER–乳腺癌的细胞增殖侵袭和干性具有抑制作用。结论AR和PDEF在ER–乳腺癌中高表达且二者存在共表达关系,PDEF是AR的下游调控分子且发挥促癌作用。AR-PDEF信号通路在诱导ER–乳腺癌恶性表型机制中发挥重要作用;联合AR和PDEF为治疗靶点可能会为ER–乳腺癌患者选择新的治疗方案提供依据。