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转录因子是一类具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称反式作用因子。转录因子普遍存在于真核生物中,其中MYB转录因子是真核生物中存在的最大家族之一,它有一段与DNA相结合的高度保守的MYB序列。MYB转录因子在RNA聚合酶的共同作用下,参与转录的起始过程,从而达到调控基因表达的功能。1982年Klempnauer在禽成髓瘤病毒中鉴定出一个能导致急性成髓细胞白血病的癌基因v-myb,MYB因此命名,之后的研究发现,动物细胞中也存在相应的原癌基因c-myb,1987年,Paz-Ares首次在玉米中分离鉴定出ZmMYB基因,随后大量的植物MYB基因被鉴定得到。目前,已在水稻、拟南芥、葡萄、玉米、杨树、苹果等多种植物中对MYB基因进行了系统的研究。研究表明,MYB家族与植物的生长发育、代谢调控、光合作用、细胞分化、细胞周期,激素及环境因子应答、植物叶片器官等的建成具有重要的调节作用。桑树(morus)是一种多年生木本植物,具有很高的经济价值,桑树除了作为家蚕主要的食物来源之外,它的叶、皮、果等均可入药。例如,现代药理发现桑叶中含有丰富的多酚、黄酮、多糖、多种维生素等生物活性物质,具有降低血糖、延缓衰老、抑菌和抗氧化等功效。桑皮中含有丰富的白芦藜醇,它能够阻止低密度脂蛋白的氧化,具有潜在的防癌、防治心血管疾病、抗病毒及免疫调节等作用。桑葚因酸甜可口、营养价值丰富而越来越受到人们的青睐,据报道,桑葚中含有大量的黄酮类化合物,尤其是成熟的桑葚中含有丰富的花青素,它们具有抗炎症、抗氧化、抗肿瘤、调节血脂等作用,有极高的生物活性。类黄酮合成途径中的关键酶的表达主要受到上游转录因子的调控,其中MYB转录因子就是类黄酮合成途径的主要的调控基因之一,到目前为止,桑树中调控类黄酮合成途径的MYB转录因子的研究鲜有报道,随着川桑全基因组测序的完成,使得川桑MYB家族的基因分析成为可能、也为剖析桑树花青素合成途径的关键调节因子提供理论基础。本文章通过生物信息学的方法,从川桑全基因组数据库中鉴定到了含MYB结构域的川桑蛋白序列,进一步筛选到了可能参与类黄酮合成的转录因子,并对其进行生物信息学分析。同时,我们提取了中桑5801桑葚不同发育时期的总黄酮和cDNA,利用qRT-PCR研究了类黄酮合成基因和之前鉴定的MYB基因在桑葚不同时期的转录水平变化,并对桑葚总黄酮含量、类黄酮合成基因以及MYB基因转录水平的变化做了相关性分析,研究黄酮结构基因和MYB转录因子之间的关系。本研究所获得的结果如下：1、桑树中MYB基因的生物信息学分析利用生物信息学的方法在川桑基因组中鉴定获得了128个含MYB结构域的转录因子：包括35个MYB-related、90个R2R3-MYB口3个3R-MYB,对鉴定到的90个R2R3-MYB的基因信息、氨基酸保守序列和系统进化关系进行分析,按照R2R3-MYB的N-端保守性和C-端易变性,我们将川桑R2R3-MYB划分为33个亚家族,其中包括和拟南芥共有的25个亚家族(S1-S25)以及川桑特有的8个亚家族(S26-S33)。为了研究与桑树类黄酮合成途径相关的MYB基因,我们通过川桑和拟南芥MYB的进化关系,从中找出可能和黄酮类化合物合成途径相关的第4、5、6、7亚家族,发现在第6亚家族并不存在川桑的基因,研究表明该亚家族基因(如PAP1)对植物花青素的合成起着重要作用,本实验室之前在川桑各个组织未检测到花青素合成基因ANS的表达,可能与川桑在该家族基因的缺失有关；此外,我们得到了川桑第4、5、7亚家族的基因MnMYB4-1、MnMYB4-2、MnMYB5-1、 MnMYB5-2、MnMYB7-1以及在这些亚家族同一分支(G1)上筛选到的可能和黄酮合成相关基因MnMYB4、MnMYB27-1做进一步的分析。在plantCARE数据库中对MnMYB4-1、MnMYB4-2、MnMYB5-1、MnMYB5-2、 MnMYB7-1、MnMYB4、MnMYB27-1上游启动子序列进行调控位点预测,结果表明,这些基因上游有大量与光响应相关的调控元件,表明这些基因的调控和光照密切相关。此外,在MnMYB4和MnMYB27-1上游还发现了与黄酮生物合成相关的MYB转录因子的作用位点MBSI,推测这两个基因可能作为下游调控基因参与到黄酮化合物的合成中来。2、黄酮合成相关基因的表达分析为了进一步研究相关MYB基因与类黄酮合成途径的关系,我们收集桑树品种5801不同时期的桑葚S1(绿色)、S2(绿色到红色)、S3(红色到紫色)、S4(紫色),提取四个时期的RNA和总黄酮,通过qRT-PCR检测桑树黄酮合成相关结构基因和相关MYB基因在桑葚不同发育时期的表达情况,结果表明：该桑树品种总黄酮含量在桑葚S2和S4期分别为0.82%和1.04%,处于较高水平,在S1和S3期分别为0.51%和0.62%,处于较低水平。MaMYB5-1和MaMYB7-1在5801桑葚四个发育时期中表达量都较低且在桑葚发育的四个时期与桑葚黄酮合成相关基因如CHS1、CHS2、CHI1、F3H1、F3’H1、ANS呈负相关性,与原花青素合成相关基因ANR成正相关,相关值分别为0.906和0.902,推测MaMYB7-1可能和MaMYB5-1共同参与调控5801桑葚中原花青素的合成。MaMYB4-1、MaMYB4-2、MaMYB4、MaMYB27-1表达分析显示,它们与结构基因的调控成正相关,MaMYB4与黄酮醇合成基因FLS呈显著正相关,相关值为0.952,而与原花青素合成相关基因ANR成显著负调控,推测该转录因子可能激活或抑制FLS和ANR的合成。