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随着动物转基因技术的发展，鸡输卵管生物反应器的研究已成为转基因研究的热点之一。本研究在成功克隆了鸡卵清蛋白（OV）基因5’端调控区的基础上，构建了调控hEPO基因的质粒表达载体pOV-B，用脂质体包埋该质粒，然后对供体鸡x期胚盘细胞进行遗传操作，显微注射入同期发育的受体鸡胚盘，采用代用蛋壳法培养，制备出整合了hEPO基因的转基因鸡胚，为制作hEPO的鸡输卵管生物反应器奠定了基础。 提取鸡输卵管组织的基因组DNA，用特异引物PCR扩增出1.1kb卵清蛋白基因5’端调控区，经电泳初步鉴定为目的基因后，连入pMD18-T载体。为进一步鉴定卵清蛋白基因5’端调控区是否具有调控作用，对1.1Kb的卵清蛋白基因5’端调控区进行测序，结果显示转录起始位点、TATA框、上游启动子成分、TATA框样序列、短回文序列以及激素依赖性调控元什都没有发生变化，可以作为调控序列。因此所克隆的卵清蛋白5’瑞调控区可用米启动外源基因的表达。 庄对质粒pBCE鉴定的基础上，陶建pOV-B。用限制性内切酶从质粒pBCE酶切出牛α-S1-酪蛋白启动子，将卵清蛋白基因5’端调控区与切除了牛α-S1-酪蛋白启动子的pBCE线性片段相连，转化大肠杆菌DH5α菌株，挑选出阳性克隆，用PCR初步鉴定为阳性后，再用Xba I、Sac I、BamHI进行酶切鉴定。Sac I酶切结果说明两者已经连在一起；BamHI酶切结果说明hEPO基因和卵清蛋白基因5’端调控区部在质粒上；Xba I酶切结果说明卵清蛋白基因5’端调控区止向连接在hEPO基因的上游。从以上鉴定结果看出卵清蛋白基因5’端调控区调控hEPO基因的质粒表达载体pOV-B构建成功。 用脂质体包埋质粒pOV-B，制得脂质体DNA复合物，把该复合物和供体鸡x期胚盘细胞于37℃，融合0.5h，然后显微注射入同期发育的受体胚盘，代用蛋壳法培养。共注射450枚鸡胚，孵化至第3天时，成活率为55.56％；第18天时，成活率为29％；最后的出雏率为4.9％。孵出22只雏鸡中有2只头部有少许黑毛，两只脚呈黑色，从表型看供体细胞已经嵌合入受体。 在孵化过程中，挑选死胚。对1～3日龄死胚，保存全胚；对4～7日龄死胚，两侧性腺大小基本相同，取其两侧性腺保存：对8～21日龄死胚，左侧性腺明显大于右侧，取其左侧性腺保存；对于出雏的活鸡，解剖后，分别取眼、肉、脑、肺、肠、胃、肝、雌性性腺、羽毛囊及血液保存，以备检测。 针对hEPO基因设计其中一段的特异性引物，用PCR检测上述所保存的564个样品，其中3日龄死胚，213个样；4～7日龄死胚，73个样；8～21日龄死胚，48个样：雏鸡22只，220个样。检测阳性结果共95个，其中3日龄死胚，阳性结果89个，阳性率为41.78％；4～7日龄死胚，阳性结果4个，阳性率为5.48％；8～21日龄死胚，阳性结果2个，阳性率为2.25％；雏鸡无一个PCR阳性。PCR阳性都集中在16日龄以前的死胚。 山东农业大学硕士学位论文（2002） 点杂交进一步鉴定，把上述阳性 PCR产物用地高辛标记，X｝4～16日龄的死胚进行点杂交。点杂交阳性有4个：4～7日龄死胚有3个阳性，8～16日龄死胚有1个阳性，点杂交阳性集中在10日龄以前的死胚。 从实验结果可看出hEPO基因己经导入鸡生殖系统，但是否导入鸡的性细胞系还未知。虽然未获得转基因的活鸡，但得到了转基因的早期胚胎，说明用此法制作hEPO的鸡输卵管生物反应器是可行的，需要改进的是进一步提高嵌合入性腺的比率，培养出嵌合入性腺的活鸡。