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从天然产物中寻找抗肿瘤活性成分，是抗肿瘤药物开发的重要策略之一。据统计，从1940年到2006年几十年间所应用的抗肿瘤药物中，有60%来自天然产物或其衍生物，其中如来源于植物的长春新碱、鬼臼毒素、紫杉醇及喜树碱等抗肿瘤药物已经被批准上市，并被广泛应用。但是这些化合物在植物中的含量较低，增加了分离纯化的难度，提高了成本。另外，珍稀植物的过度采伐会对生态环境带来恶劣影响。据估测，全世界真菌约有150万余种，已知真菌不及总数的10%，而真菌产生的代谢产物的种类更是不计其数。迄今为止，从真菌次级代谢产物中已发现包括紫杉醇、长春碱类及鬼臼毒素等100余种具有抗肿瘤活性的化合物，其结构类型与作用机制均体现出了丰富的多样性，是“天然药物的宝库”，受到了研究人员的青睐。在工业生产中，真菌发酵具有易于操作、不易污染、生产成本低、生产周期短等优点，并可通过诱变育种及遗传改造等手段来提高菌种性能，容易实现大规模生产。同时，利用真菌开发抗肿瘤药物还可以减少野生植物的过度采伐。因此从真菌中开发抗肿瘤药物，不仅具有良好经济前景，而且对自然资源的保护具有重要的意义。一、抗肿瘤活性菌株的筛选本研究利用MTT法对82株真菌的代谢产物进行筛选，得到4株对Hela细胞抗肿瘤活性较强的菌株，其中菌株FI29活性最强，IC50值为16.1μg/ml，因此将菌株FI29作为后续的研究对象。二、菌株FI29的鉴定及生物学特性研究1.本研究利用形态学和分子生物学的方法，将菌株FI29鉴定为Edeniagomezpompae。2.本研究发现菌株FI29在SDA平板培养基上，培养温度为28℃时，生长最迅速。3.本研究通过对促孢条件的摸索，首次发现E. gomezpompae在燕麦培养基，28℃培养4w的条件下，可以形成厚垣孢子，并对其形成过程进行了观察。4.利用最大简约法对20种26株格孢科真菌以及E. gomezpompae进行了系统进化分析，这是对E. gomezpompae及Edenia在格孢科家族分类学地位的首次探讨。结果表明，在格孢科中Edenia与Alternaria（链格孢属）及Ulocladium（细基格孢属）的属间亲缘关系较近。这些发现加深了对罕见真菌Edenia gomezpompae的认识，为其开发利用奠定了实验基础。三、 Edenia gomezpompae次级代谢产物的结构研究1.本研究通过对菌株FI29的固体发酵，得到了乙酸乙酯粗提物约16g，对Hela细胞的IC50值为8.1μg/ml。2.利用硅胶柱层析、反相ODS柱层析、TLC和HPLC等方法，并通过对活性追踪，得到了EG7-1和EG7-2两种化合物，纯度分别为87%和92%，对Hela细胞的IC50值分别为8.8μg/ml和2.2μg/ml。3.利用HPLC-MS法对EG7-1和EG7-2这两种化合物的结构进行解析，根据质谱图及查阅相关文献，推测两者均为萘醌螺缩酮类化合物，分子式分别为C22H21O5和C24H27O5。这两种化合物的发现丰富了萘醌螺缩酮类化合物家族的多样性，并为抗肿瘤药物的设计提供了新的思路。四、 Edenia gomezpompae次级代谢产物抗肿瘤作用的研究1.本研究利用MTT法检测了化合物EG7-2对Hela、BxPC-3和H460细胞的抗肿瘤活性，结果表明化合物EG7-2对Hela、BxPC-3和H460细胞均有一定抗肿瘤活性，其中对Hela细胞的活性最强。2.将化合物EG7-2分别以不同浓度、不同时间作用于Hela细胞，结果发现随着药物浓度的增加或作用时间的延长，化合物EG7-2对Hela细胞的抑制作用明显增强，呈明显的浓度依赖性和时间依赖性。3.利用DAPI染色法观察发现，EG7-2作用于Hela细胞后，细胞核染色加深，边缘化呈新月形，为细胞凋亡时的特征。4.利用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测了EG7-2对Hela细胞的影响，结果表明，化合物EG7-2可诱导Hela细胞凋亡，并且随着EG7-2浓度的增加早期凋亡率逐渐升高。5.利用PI单染法检测了化合物EG7-2对Hela细胞周期的影响，结果表明，当EG7-2的浓度为20μg/ml时，G2/M期细胞分数显著增加，说明EG7-2会对G2/M期产生影响。通过初步探讨化合物EG7-2对Hela细胞的作用机制，为将萘醌螺缩酮类化合物开发成新型的抗肿瘤药物提供了理论依据。五、根癌农杆菌介导的Edenia gomezpompae遗传转化体系的建立1.本实验首先利用1%纤维素酶、1%蜗牛酶和1%溶壁酶的混合酶液，在30℃，100rpm，酶解3h的条件下，可以制备出E. gomezpompae的原生质体，产量约为2.5×105个/ml。2.本实验以原生质体为受体材料，利用ATMT技术，实现了E.gomezpompae遗传转化体系的构建。3.通过对突变体遗传稳定性的测定和PCR的分析，表明转化的阳性率接近100%，并且突变体具有遗传稳定的特点。根癌农杆菌介导的E. gomezpompae遗传转化体系的建立，为从分子水平探讨E. gomezpompae生物合成的机制提供了有效的实验途径，并为进一步的突变育种和遗传改造解决了技术难题。