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本研究首先用PCR法从课题组构建的含CD基因的重组腺病毒（rAd-CD）中扩增出CD基因，将其插入腺病毒穿梭质粒（pAdTrackCMV），而后从含ES基因的分泌型表达质粒pEZZ-18-ES中扩增出glyES基因，将两者融合构建成含CDglyES融合基因的腺病毒穿梭质粒phdTrackCMV-CD。然后转化大肠杆菌BJ5183，构建出重组腺病毒质粒pAdTrackCMV-CDglyES，用卡那霉素筛选重组质粒，用限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序对插入基因进行鉴定。然后经脂质体介导转染293细胞进行包装和扩增，借助报告基因监控和筛选重组腺病毒。采用氯化铯密度梯度离心纯化病毒，用TCID50法滴定其浓度。为了证实融合基因CDglyES具有双重活性，进行了初步的体外抑瘤试验。将纯化重组腺病毒稀释成1×1010TCID50/L，分别感染肝癌细胞株SMMC-7721和宫颈癌细胞株Hela 24小时，给予前药5-FC，继续培养48小时后，检测肿瘤细胞生长抑制率；并与对照重组病毒rAd-CD和rAd-LacZ的肿瘤细胞生长抑制率进行比较。结果显示融合基因系统对SMMC-7721细胞的抑制率达78.2％，与rAd-LacZ／5-FC（52.2％）系统比较有显著性差异，P＜0.01；融合基因系统（78.1％）和rAd-CD／5-FC系统（77.7％）对Hela细胞的生长抑制率与rAd-LacZ／5-FC系统（50.2％）比较有显著性差异，p＜0.01；而rAd-CDglyES／5-FC系统和rAd-CD／5-FC系统比较无显著性差异，p＞0.5。这一结果证实了CDglyES融合基因中，基因的融合未影响 硕士研究生学位论文CD基因活性。浓缩的rAd一cDglyES细胞培养上清液对脐静脉血管内皮细胞ECV一304增殖的抑制率为78.7%，同样浓缩的rAd一CD细胞培养上清液抑制率仅为24.2%，有显著性差异，P<0.01，同样证实了CDglyES融合基因中基因的融合未影响ES基因的活性。 在体内水平的试验中，对津白11号小鼠的MA737乳腺癌模型进行了抑瘤试验。将MA737移植瘤小鼠分为7组，分别是空白对照组、单放组、单予CDgl妞S组、CDglyES+放疗（14Gy）组、CDgl正S+5一FC组、CDglyES+5一FC+放疗（14Gy）组、CDglyES+5一FC十放疗（7Gy）组。CDglyES用法为排肠肌注射，5一FC用法为腹腔注射。设定了多个观察指标对各组结果进行比较:（I）肿瘤大小:试验结束时各组分别处死一只瘤体大小居中的小鼠并作解剖，各组平均瘤体大小排列顺序 （由大到小）为第1组、第3组、第7组、第5组、第2组、第4组和第6组;（2）平均瘤体重量:第1组的肿瘤最重，生长最为迅速，按分组要求处理后各组肿瘤均表现出不同程度的生长延迟，第6组的生长延迟最为明显，远高于其余各组，肿瘤平均重量也远小于其他各组;（3）中位生存期:第1组的平均中位生存期最短，第6组的平均中位生存期明显长于其余各组，P<0.01，其余各组平均中位生存期排序为（由短到长）第3组、第2组、第5组、第4组、第7组;（4）病理组织形态:按分组要求处理25天后，第l组的肿瘤内仍可找到较多的核分裂象，肿瘤生长仍然旺盛，第6组的肿瘤内可见较多的凋亡现象，肿瘤血管分布也明显少于其余各组;⑤肺转移情况:按分组要求处理25天后，第1组的肺组织内有肿瘤转移灶且体积较大，将正常肺组织挤压变形、肺泡壁塌陷，而第4组肺内转移灶明显小于第1组，转移性肿瘤细胞出现比较多的坏死、组织碎片较多，第6组小鼠肺内转移灶几乎难以发现，肺泡壁基本维持正常形态。 3 硕士研究生学位论文重组腺病毒（rAd一CDglyES）联合放疗组小鼠的放疗相关毒性反应与对照组相比并无显著增加。以上结果证实:首先，含双功能融合基因的重组腺病毒（「Ad一CDglyES）具有CD基因活性，对肿瘤细胞具有直接杀伤作用，亦具有ES基因活性，对肿瘤细胞具有间接的抑制、杀伤作用;其次，该重组腺病毒表达产物具有ES活性，能抑制肿瘤新生血管的形成，进而阻止肿瘤细胞发生远处转移;第三，本研究首次揭示该重组腺病毒具有CD及ES双重对放疗的增敏作用，其中CD基因将5一FC转化为5一FU，发挥放疗增敏作用，ES基因表达产生内皮抑素，也起到了放疗增敏作用，其机制可能是将肿瘤血管的内皮细胞转变成为射线细胞毒性作用的靶细胞，导致其有丝分裂后死亡或凋亡。 本研究应用重组腺病毒载体介导CDglyES融合基因进行了初步的体外和体内抑瘤试验，结果证明重组腺病毒rAd一cDglyEs在体外、体内水平均具有直接和间接抑瘤作用，并具有明显的放疗增敏作用，证明本研究的构思正确取得了预期的结果。同时还有许多问题，如基因治疗中前体药物给予的最佳时间和剂量，联合放疗的最佳时间及剂量，何种、何形式的基因对放疗增敏作用强弱的比较，以及基因治疗+放疗对不同肿瘤的作用差异的观察等，这些问题仍需进一步深入研究，以期找到更为有效的治疗恶性肿瘤的方法。