茶树CML21启动子及CML基因家族的克隆和表达分析

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茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]是一种多年生常绿木本植物,属山茶科山茶属,是一种喜温怕寒的经济作物。由茶树叶片加工制作成的“茶”饮品被誉为“世界三大非酒精饮料”之一。环境胁迫不仅限制茶树种植区的分布,还对经济作物造成一定的经济损失,其中低温胁迫是影响茶树生长发育、茶叶产量和品质的重要因素。因此,提高茶树抗寒性是目前茶树研究人员亟待解决的课题。然而,从生理生态水平上培育抗寒性茶树品种,不仅选育周期长还难以控制育种方向以获得理想表型。所以,研究茶树在非生物胁迫的分子响应机制,通过生物技术手段有针对性地提高茶树抗逆性,对选育茶树抗性优良品种具有重要意义。针对上述科学问题,本研究对茶树类钙调蛋白基因CsCML21启动子(Calmodulin like 21 promoter,pCsCML21)进行功能分析,并从茶树良种’龙井长叶’中扩增出五个茶树CML基因,利用生物信息学和分子生物学等技术手段深入研究了它们在低温(10℃)、聚乙二醇6000(Polyethylene glycol 6000,PEG 6000)(20%)、氯化钠(Sodium chloride,NaCl)(200mg/L)胁迫和脱落酸(Abscisic acid,ABA)(200mg/L)诱导条件下的表达模式,详细的研究内容及结论如下:1.构建茶树CsCML21启动子(pBI101::CsCML21-F)及缺失ABRE顺式元件CsCML21启动子(pBI101::CsCML21-M)表达载体,通过农杆菌(GV3101)介导将重组表达载体导入野生拟南芥中,经PCR鉴定获得拟南芥突变体F和M植株。进一步验证重组载体的正确性和启动子的表达水平,对拟南芥突变体叶片采用β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)组织化学染色方法,直观分析pCsCML21启动子和缺失ABRE元件pCsCML21启动子启动下游GUS报告基因的表达情况。在叶中,野生型拟南齐(WT)没有GUS活性,转入重组载体的F和M突变体均有GUS基因表达,且F突变体植株较M突变体pCsCML21启动子活性更强,表明ABRE元件的缺失削弱了 pCsCML21启动子的活性。2.为了研究茶树CML基因家族的功能,通过搜索转录组数据(GenBank:SRR5075641),获得10条茶树CML同源序列,最终经筛除重复序列获得5条CsCML基因EST序列。通过RT-PCR和RACE方法获得不完整序列的3’端和5’端,拼接后将cDNA全长序列经Bioxm软件分析获得最大开放阅读框(Open reading frame,ORF),在序列两端设计特异性引物扩增到五条目的条带,大小分别为480bp、474bp、501bp、435bp和609bp,分别命名为CsCML16、CsCML18-1、CsCML18-2、CsCML38和CsCML42。系统进化树分析表明,这五个茶树CML基因与其他物种相对应的CML基因序列具有高度同源性,说明这些序列为CML直系同源基因。生物信息学分析结果表明,五个茶树CML均无跨膜结构且是亲水蛋白,除CML18-1为膜外蛋白,其它四个均为膜内蛋白。3.通过实时荧光定量分析了低温、PEG、高盐胁迫和ABA诱导下茶树CML基因的表达水平,结果显示:除CsCML18-1外,其它四个茶树CML基因在低温胁迫下均为上调表达;在干旱胁迫下,除CsCML38表达量上调外,其它四个CML基因均表现出类似的下调模式;在ABA诱导下,CsCMLM、CsCML18-1、CsCML38別表达量下调,CsCML18-2和CsCML42表达量上调;在高盐处理下,CsCML16、CsCML18-2和CsCML42表达量为上调模式,而CsCML18-1和CsCML38表达模式恰好相反。组织荧光定量表达结果显示,在茶树根、茎、叶、花中均检测到五条茶树CsCML基因mRNA的积累,且表现出组织特异性表达。
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