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全球气候变暖是人类社会面临的一大挑战,为解决化石燃料的过度依赖并缓解温室气体释放,可再生替代能源的研发亟待进行。利用微生物转化生物质合成液体燃料是减少温室气体排放和降低化石燃料依赖的一种有效策略。然而,传统发酵过程以谷物和甘蔗等农作物为原料,将引起“粮食与燃料”之间的矛盾；以木质纤维素为原料合成生物乙醇可以有效缓解C02释放,但无法直接减少大气中C02的含量；光合自养微生物虽然可以直接利用大气中的C02,但其目标燃料或高附加值化工产品的产量尚无法达到产业化要求。因此,若将异养工程菌高效发酵木质纤维素合成生物燃料的特性与自养微生物直接利用C02的优势进行结合,同步实现生物乙醇的高效合成与C02的循环利用,将“碳中性”过程转变为C02减量的生物过程,将更有效的调控和减少C02的排放。基于此,本研究在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae工程菌中构建了以大肠杆菌Escherichia coli GroE为基础的外源基因表达平台,有效实现了原核蛋白在真核体系中的翻译后修饰,并在此基础上将卡尔文循环(Calvin Cycle)中磷酸核酮糖激酶(Phosphoribulokinase, PRK)和核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase, RuBisCO)引入S. cerevisiae,构建外源还原型戊糖代谢途径,循环利用部分乙醇发酵过程中释放的CO2,提高乙醇产量。本研究的主要内容和结论如下：(1)研究通过共表达E. coli的HSP60分子伴侣体系GroE,首次实现了E.coli木糖异构酶、阿拉伯糖异构酶以及Agrobacterium tumefaciens阿洛酮糖差向异构酶在S. cerevisiae中的有效表达,证明HSP60分子伴侣体系在真核与原核细胞之间的差异是导致部分细菌蛋白无法在酵母中有效表达的原因。由于GroE体系基于分子间的疏水效应,且与HSP70和HSP90等分子伴侣体系的相互作用较少。因此,共表达E. coli GroE伴侣蛋白体系可以作为一种广适性的翻译后修饰工具,协助细菌外源蛋白在酵母中达到其功能构型,从而实现其有效表达。(2)在E. coli GroE平台的基础上,在S. cerevisiae工程菌中成功表达了Rhodospirillum rubrum RuBisCO,并通过增加RuBisCO编码基因cbbM的拷贝数提高了其活性。结果表明,RuBisCO和PRK的共表达可以成功构建还原型戊糖代谢通路,实现发酵过程中C02的循环利用,提高木糖发酵效率和乙醇产量。同时,还原型戊糖代谢通路的建立可以使C02可以作为电子受体,缓解XR(Xylose reductase)/XDH (Xylulose dehydrogenase)代谢路径在发酵木糖时氧化还原反应的失衡,减少副产物甘油和木糖醇的产生。(3)研究发现C02对S. cerevisiae工程菌发酵合成乙醇具有明显影响。通过CO2吹扫增加初始C02浓度可以有效提高乙醇产量并减少副产物的积累。该效应不受糖酵解及戊糖磷酸代谢通路等碳源代谢途径以及培养体系的影响。研究利用合成生物学手段,通过调控丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase, PYC)的表达强度发现,C02作用机制受PYC的调控,且其可能作为全局调控因子实现对乙醇发酵的促进。