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α-半乳糖苷酶也称蜜二糖酶,是催化α-半乳糖苷键水解的酶类,是广泛存在于自然界的一种外切糖苷酶。能催化α-半乳糖苷键的水解,即能水解非还原性末端以α键结合的半乳糖苷化合物,因此它能水解蜜二糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖,还能水解含有α-半乳糖苷键的杂多糖。 现今对α-半乳糖昔酶的研究表明,该酶在饲料、制糖、食品、医药工业等领域具有广泛的应用前景。豆粕是目前应用最广泛的植物性蛋白饲料,但豆粕中含有一类α-半乳糖苷低聚糖抗营养因子,影响营养物质的吸收利用,如棉子糖,水苏糖等。α-半乳糖苷酶的应用一方面使这类寡糖得以利用,同时可以通过减少抗营养因子来提高豆粕的利用率,消除胀气。实验表明,添加α-半乳糖苷酶可提高豆粕饲料有效代谢能8%、可消化蛋白7%。目前我国豆类饲料的年消耗约为1000万吨,广泛使用酶制剂后,相当于增加利用豆类达80万吨/年。因此开发α-半乳糖苷酶作为饲料添加剂,极富社会与经济价值。 本研究通过比较α-半乳糖苷酶基因MEL1在酿酒酵母、大肠杆菌、毕赤酵母中的表达情况,来选择α-半乳糖苷酶适宜的表达系统,为α-半乳糖苷酶最终的工业化生产奠定基础。 1.α-半乳糖苷酶基因MEL1在酿酒酵母中的表达 用PCR方法从酿酒酵母AH109中扩增出α-半乳糖苷酶MEL1基因片段,与乙醇脱氢酶组成型启动子重组后构建成表达重组质粒pGAD-GAL。将重组质粒pGAD-GAL转化不带α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母后,在预先涂布有X-α-Gal的亮氨酸缺陷培养基(SD/-Leu)平板上选择到蓝色菌落。实现了α-半乳糖苷酶在酵母内的组成型表达,但其表达量低,蛋白分泌能力差。 2.α-半乳糖苷酶基因MEL1在大肠杆菌中的表达 酵母编码α-半乳糖苷酶的基因MEL1被扩增并克隆到表达载体pRSET中。重组质粒pRSET-Gal转化至相应的受体菌BL21(DE3)PlysS,阳性克隆经液体培养和IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE分析,在50ku处有一目的分子大小的亮带。裂解细菌后经X-α-Gal的显色底物反应,液体变蓝。表明:α-半乳糖苷酶基因MEL1在大肠杆菌中得到了表达,糖基化对于维持此酶的生物活性不是必须的,但α-半乳糖苷酶在此系统中表达后,往往形成包涵体,蛋白的分离纯化及酶复