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目的通过检测Cap43在非镍接触肺癌患者肿瘤组织和血清中的表达及镍接触肺癌患者血清中的表达，探讨Cap43作为镍接触肺癌肿瘤标志物的可行性。一、研究对象收集79例自中国医科大学附属一院胸外科手术切除后经病理证实的肺癌及对照标本常规包埋制成蜡块常温保存为免疫组化检测备用；从免疫组化收集的肺癌组织中未做蜡块前随机选取28例新鲜肺癌及对照组织，保存于-80℃冰箱为免疫印迹检测备用；从免疫组化收集的肺癌组织中选取9例新鲜肺癌组织，保存于-80℃冰箱为实时荧光定量（Realtime RT-PCR）检测备用；收集91例自中国医科大学附属一院胸外科肺癌患者的血清标本（其中79例为上述免疫组化所收集肺癌组织标本患者同体血清标本）；收集吉林省镍业公司镍接触工人肺癌患者5例、镍接触工人矽肺患者20例及镍接触健康体检工人200例血清标本，保存于-80℃冰箱为双抗体夹心ELISA检测备用。二、实验材料1、实验试剂羊抗人NDRG1多克隆抗体PcAb（Santa Cruz公司，美国），兔抗人CAP43 PcAb（Invitrogen公司，美国），HRP标记的兔抗羊IgG（Jackson ImmunoResearch，美国），标准品NDRG1蛋白（US Biological公司，美国），S-P免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司），Western bloting化学发光试剂盒（Santa Cruz公司，美国），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，美国），兔抗人β-actin PcAb（SantaCruz公司，美国），预染蛋白分子量标准和组织裂解液（碧云天生物技术研究所，海门），TRIZOL试剂（Invitrogen公司，美国），RNA酶抑制剂（Promega，美国），MMLV反转录酶（Promega，美国），dNTP混合液（华美生物工程公司），Oligo（dT）18（上海生工生物工程有限公司），Sybergreen（Molecular Probes，美国）。2、实验仪器酶标仪（BIO-RAD公司，美国），灌胶、电泳及转移设备（上海天能科技有限公司），FeroTec Gradien PCR基因扩增仪（杭州大和热磁电子有限公司），Rotor-Gene 3000 Realtime PCR仪（Corbett Research，澳大利亚）。三、实验方法1、免疫组化法收集的肺癌组织标本均石蜡包埋，切片。免疫组化采用S-P法进行，一抗羊抗人NDRG1 PcAb抗体，4℃孵育过夜，染色步骤严格按说明书进行，DAB显色，苏木素复染后常规脱水，透明，封片。经显微照相所得数码图像经图象分析系统进行半定量测定。2、免疫印迹法从每例新鲜肺癌组织标本中各取约200mg，加入蛋白裂解液，匀浆后离心，取上清；BCA试剂盒测定蛋白浓度；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；电转印；所得PVDF膜经非免疫兔血清4℃封闭过夜；加一抗羊抗人NDRG1 PcAb，室温2h；加HRP标记的兔抗羊IgG，室温孵育1．5h；用化学发光试剂盒显色；所得X光片经扫描仪采集图像，并通过凝胶图像分析系统进行半定量分析。3、Realtime RT-PCR法从每例新鲜肺癌组织标本中各取约100mg组织样品，加入TRIZOL后匀浆后常规两相分离、RNA沉淀、溶解后提取RNA；紫外吸收测定法及RNA电泳对其浓度及纯度测定；MMLV法常规进行反转录cDNA合成；制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板；配置Realtime PCR反应体系；配置好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR反应；根据绘制好的梯度稀释DNA标准曲线得到各样品目的基因和β-actin的浓度结果。4、双抗体夹心ELISA法本测定法通过棋盘滴定法优化。羊抗人NDRG1 PcAb包被96孔板，4℃箱孵育过夜，室温封闭1h，之后PBST洗涤；加待测血清及Cap43蛋白标准品，室温1h之后PBST洗涤；加兔抗人Cap43 PcAb，室温1h后PBST洗涤；加HRP标记的羊抗兔IgG，室温1h，洗涤；加TMB显色15min；之后加2N H2SO4终止反应；酶标仪450nm测量吸光度A值（OD值）。四、判断标准1、免疫组化阳性判断标准以肿瘤细胞的胞浆／胞膜内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准，同时设定阴性对照。在普通光学显微镜下判定结果，每张切片检测20个高倍视野，按切片中显色细胞的比例判定，免疫组化染色阳性细胞数>10％，即认为该病例阳性，否则为阴性。2、免疫印迹阳性判断标准以Marker指示目的蛋白分子量部位（43KD）出现特异性蛋白条带，且该条带经图像分析软件分析半定量结果（经内参校正后相对含量）大于其癌旁非肿瘤组织对照（校正值）为阳性判断标准。3、Realtime RT-PCR阳性判断标准以实验组目的基因的校正后的相对含量大于癌旁非肿瘤组织对照组相对含量为阳性判断标准。4、双抗体夹心ELISA阳性判断标准以P／N（即实验组OD值比正常对照组OD值）>2．1为阳性判定标准。五、统计学处理用SPSS 13．0统计软件对数据进行统计分析，结果用（?）±S表示。实验组和对照组组间计量资料比较采用独立样本的T检验，实验组组间两两比较采用SNK-q检验；两组率之间的比较采用四格表资料的Fisher确切概率法检验（样本总数<40）和配对四格表资料的x2检验；计量资料的相关性分析采用Pearson相关性检验。检验水准α=0．05。结果一、Cap43在非镍接触肺癌患者肿瘤组织中的表达免疫组化、免疫印迹及Realtime RT-PCR法结果提示：Cap43在非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）组织中mRNA和蛋白表达都高于癌旁非肿瘤组织对照（P<0．05）；该基因在肺腺癌组mRNA和蛋白表达都明显高于肺鳞癌组（P<．05）。免疫印迹结果还提示Cap43蛋白表达水平与肺癌组织学分化程度呈负相关。以上结果提示Cap43在NSCLC组织中高表达，且其表达水平与组织学分型密切相关。二、Cap43蛋白在非镍接触肺癌患者血清中的表达建立定量检测血清Cap43蛋白含量的双抗体夹心ELISA法，并绘制标准曲线。标准曲线方程为：（?）=0．53566+0．00046x，R2=0．9939，P<0．0001。和病理诊断相比，该方法的敏感度（SE）为84．51％，符合率为73．63％。初步检测91例肺癌患者血清表达结果提示：Cap43蛋白在非镍接触肺癌患者血清中高表达（P<0．05），且其表达水平在腺癌组中明显高于鳞癌组（P<0．05）。三、Cap43蛋白在非镍接触肺癌患者血清和肿瘤组织中表达的相关性分析通过对比免疫组化法（组织学检测法）和双抗体夹心ELISA法（血清学检测法）检测79例肺癌患者血清和肿瘤组织的检测结果，显示：两者之间有明显的相关性（r=0．915，P=0．029<0．05）。四、Cap43蛋白在镍接触肺癌患者血清中的表达Cap43蛋白在镍接触人群（肺癌、矽肺、健康）组中表达明显高于正常对照组（P<0．05）；该蛋白在镍接触肺癌组和镍接触矽肺组表达均出现了增高，其表达水平明显高于镍接触健康人群组（P<0．05）。结论（1）Cap43在非镍接触NSCLC组织中高表达，该蛋白表达水平与肺癌组织学分型密切相关。Cap43在NSCLC血清中亦高表达，且与其在组织中的高表达密切相关，具有一致性。（2）Cap43有可能成为镍从业工人高危预防（肺癌、矽肺）的一个重要的血清学辅助标志物。