目的1、DVT危害大,形成机制复杂,需深入研究,本研究针对大鼠血栓形成前、血栓形成状态,应用Real-time PCR在血中白细胞检测AKT、NF-κB、TF的mRNA表达变化,应用Western Blot在静脉壁组织中检测上述目的蛋白的表达变化,分析目的基因及蛋白的表达变化趋势。2、采用生物信息学技术,分析上述基因与血栓形成中的关键角色内皮细胞的关联性,为DVT分子层面发病机制提供理论基础,使下一步研究更有针对性、目的性。材料与方法一、建立DVT大鼠模型及取材选取90只SPF级SD大鼠；实验前适应性喂养3-5天。随机抽取10只正常大鼠做为对照组。剩余80只分为手术组和假手术组。正常对照组(10只)：正常饲养,不进行任何处理；假手术组(40只)：腹腔麻醉,腹正中线逐层开腹,不分离、暴露血管,逐层关腹,术后普通环境、正常饲养；实验组(40只)：腹腔麻醉,腹正中线逐层开腹,分离暴露下腔静脉,5-0爱惜康缝合线沿下腔静脉平行、紧贴放置,再用4-0爱惜康缝合线结扎此处下腔静脉,再抽去并排的5-0爱惜康缝合线,关腹,正常饲养；各组造模后按2h、8h、24h、72h时间点位进行开腹下腔静脉结扎点上方0.5cm处采血,取距结扎线1.0cm的下腔静脉壁组织取材。二Real-time PCR检测DVT大鼠模型血中AKT、NF-κB、TF的mRNA表达变化采用Trizol法提取血液总RNA,应用Primer5.0引物设计软件,设半定量PCR逆引物,将各组大鼠RNA逆转录为cDNA,以GAPDH为内参照,采用real time-PCR检测AKT、NF-κB、TF基因的表达量。三Western bolt检测DVT大鼠下腔静脉壁组织中P-AKT、NF-κB、TF蛋白表达变化将获取的大鼠下腔静脉壁组织给予液氮保存后行western bolt检查P-AKT、 NF-κB、TF蛋白含量。四、统计学分析：采用Spss17.0对数据进行统计分析,计量资料用x±s表示,组间差异用单因素方差分析(One-Way ANOVA), P<0.05有意义。结果1.大鼠造模后相应时间点位取材观察及切片,对照组与假手术组组织肉眼观察及病理切片均未见血栓形成,建模后2h、8h、24h及72h较对照组观比较均可见血栓形成：2h可见血管内少量黑色凝块样物质；8h可见明显肉眼血栓形成,静脉壁管壁青紫,有暗红色血栓形成；24h可见完全性血栓形成,部分与血管壁粘连；72h开始部分出现血栓机化；2.DVT大鼠模型血液中假手术组与正常组两两比较无差异(p>0.05)。手术组与正常组相比较,手术组中AKT基因表达变化在造模后24h、72h时下调明显(p<0.05); NF-κB基因表达变化在造模后8h及24h时上调明显(p<0.05)。TF基因表达变化在造模后8h、24h时上调明显(p<0.05)。3.大鼠下腔静脉组织中,假手术组与正常组两两比较无差异(p>0.05)；手术组与正常组相比较,手术组中P-AKT蛋白表达变化在造模后24h、72h时下调明显(p<0.05); NF-κB蛋白表达变化在造模后24h、72h时均上调明显(p<0.05);TF蛋白表达变化在造模后72h时下调明显(p<0.05)；进一步的Pathway生物信息学分析提示：静脉瘀滞后,内皮细胞活化,内皮细胞氧化应激使膜上ROS释放增加,ROS通过PI3K-AKT信号通路激活NF-kB,促使其与TF基因上kB样部位结合,促进TF的转录活性,使TF分泌增加,促进凝血。结论1.结扎大鼠下腔静脉法建立瘀滞型大鼠DVT模型在2h开始形成血栓,8h左右可形成完全血栓,72h开始出现部分机化。2.在血栓形成前后DVT大鼠血中：AKT基因表达降低,NF-κB、TF基因表达升高；在血栓形成前后DVT大鼠静脉壁组织中：AKT蛋白表达降低,NF-κB、TF蛋白表达升高,两种不同组织中转录及蛋白水平的一致性说明前期研究中通过基因芯片及所筛选到的AKT、NF-κB、TF可信。3. AKT、NF-κB与TF三者的相互作用激活内皮细胞氧化应激、加强TF转录活性,促进凝血酶的激活等一系列反应,加强凝血,最终导致血栓形成。