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目的：
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率高，恶性程度高，导致其死亡率位居所有恶性肿瘤死亡率之首，成为世界范围内主要的公共卫生问题。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80-85%，近20年随着NSCLC基因突变图谱的绘制，NSCLC的治疗已经从经验性使用细胞毒性化疗药物转变为根据肿瘤基因分型制定的个体化治疗策略。但由于肿瘤的异质性，只有携带敏感突变的NSCLC患者临床获益。肿瘤细胞恶性增殖必然伴随活跃的DNA复制，染色质组装因子1亚基B(CHAF1B)是组蛋白分子伴侣染色质装配因子1(CAF-1)的亚基，参与DNA复制耦联的核小体组装。已有研究表明，CHAF1B在胶质瘤、前列腺癌、舌癌、乳腺癌、肾癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤组织高表达且与不良预后有关。但是，CHAF1B在NSCLC中的作用尚不明确。因此，本研究旨在了解CHAF1B在NSCLC组织表达情况、CHAF1B与临床病理指标和预后的关系以及CHAF1B对NSCLC细胞生物学行为的研究和初步的机制探讨，以识别新的驱动基因能够使更多NSCLC患者受益于靶向治疗。
方法：
1、使用免疫组织化学染色(IHC)方法检测135例NSCLC组织和癌旁组织CHAF1B的蛋白表达。另外收集27例新鲜的NSCLC组织及配对癌旁组织，使用实时定量PCR技术检测CHAF1B在转录水平上mRNA表达。对IHC半定量结果，依据时间依赖性ROC曲线确定NSCLC患者CHAF1B高表达组和CHAF1B低表达组的界值。分析CHAF1B表达高低与NSCLC患者的性别、年龄、吸烟状态、病理类型、分化程度、淋巴结是否转移、脉管是否受侵、肿瘤大小以及临床分期的关系。通过电话方式对135例NSCLC患者进行至少5年随访，对该队列患者进行生存分析。
2、通过实时定量PCR和Westernblot检测CHAF1B在人肺癌细胞系95-D，NCI-H292、A549以及人正常支气管粘膜上皮细胞系16HBE中mRNA和蛋白表达水平，筛选出CHAF1B高表达的肺癌细胞株。构建针对CHAF1B基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体，用脂质体将重组质粒转染肺癌细胞株，经G418筛选阳性克隆建立稳转细胞株。使用实时定量PCR和Westernblot法检测CHAF1B的mRNA和蛋白表达水平明确CHAF1B基因干扰效率。CCK8法检测CHAF1B对肺癌细胞株增殖能力的影响；采用克隆集落形成实验检测CHAF1B对NSCLC细胞克隆形成的影响；采用流式细胞仪检测CHAF1B对NSCLC细胞凋亡以及细胞周期的影响。
3、体内实验，将稳定转染pGPU6/GFP/Neo-CHAF1B-shRNA(CHAF1B-shRNA)和pGPU6/GFP/Neo-shNC(NC-shRNA)的肺癌细胞分别接种于裸鼠腋部皮下，建立裸鼠NSCLC皮下移植瘤模型。定期测量瘤体长径和宽径，计算瘤体体积，绘制生长曲线。在建模第40天处死裸鼠，解剖瘤体称重。应用IHC检测CHAF1B和增殖指标Ki-67蛋白表达，定量PCR检测CHAF1B的mRNA表达。
4、对于135例NSCLC的组织蜡块，使用IHC检测CHAF1B的同时，也检测增殖指标Ki-67的表达情况。并对CHAF1B和Ki-67的表达进行相关性分析。
5、为明确CHAF1B促进NSCLC增殖的初步机制，使用实时定量PCR以及Westernblot技术检测p53诱导的内源性细胞凋亡途径中p53、BAK、Bcl-2和caspase-3关键基因的表达。
结果：
1、IHC检测发现CHAF1B在正常肺组织不表达或弱表达，在NSCLC细胞核高表达。半定量分析结果显示癌组织IHC积分5.04±0.23，正常组织IHC积分0.69±0.07(n=135，P＜0.0001)。实时定量PCR分析结果同样显示NSCLC组织CHAF1B在转录水平较邻近正常组织高8.5倍，尤其鳞状细胞癌差异更显著。根据ROC曲线确定NSCLC患者CHAF1B高表达组和低表达组的界值为4.83。对患者CHAF1B表达高低与临床病理指标进行相关性分析，发现CHAF1B表达水平与性别(P=0.008)、病理分型(P＜0.001)、吸烟(P＜0.001)、分化程度(P=0.007)、临床分期(P=0.002)、肿瘤大小(P＜0.001)有关联，与淋巴结是否转移(P=0.085)、脉管是否受侵(P=0.719)、年龄(P=0.406)无关。建立临床资料与复发转移时间和生存时间数据库，绘制Kaplan-Meier曲线描述生存过程。使用log-rank检验比较CHAF1B高表达组与低表达组生存率的差异，发现低分化与中分化(x2=5.811，P=0.016)；有淋巴结转移和无淋巴结转移(x2=21.944，P＜0.001)；不同临床分期(x2=26.521，P＜0.001)；不同肿瘤大小(x2=8.553，P=0.014)；CHAF1B高表达与低表达(x2=16.716，P＜0.001)患者的生存率存在差异。运用COX比例风险回归模型发现不同临床分期、淋巴结是否转移、CHAF1B表达高低是影响NSCLC患者存活的独立危险因素，其中CHAF1B高表达患者的死亡风险是低表达患者的2.44倍。
2、采用实时定量PCR检测CHAF1B在HBE以及NSCLC细胞A549、95-D、NCI-H292的表达水平，结果显示CHAF1B在95-D细胞中表达显著增高，选择95-D细胞用于后续生物学功能研究。成功构建靶向CHAF1B基因的重组表达载体pGPU6/GFP/Neo-CHAF1B-shRNA，经验证能够有效抑制CHAF1B的表达，其中pGPU6/GFP/Neo-CHAF1B-HOMO-550对CHAF1B抑制率达70%，因此使用脂质体将其转染95-D肺癌细胞株，经G418筛选阳性克隆建立稳转细胞株。体外细胞学功能实验证明，与对照组相比，CHAF1B-shRNA组增殖能力减弱、细胞克隆形成减少、细胞凋亡增多、细胞周期S期细胞分布减少。
3、裸鼠移植瘤实验表明，CHAF1B-shRNA组较NC-shRNA组相比，移植瘤生长速度减慢，瘤体体积减小，肿瘤重量减轻；移植瘤组织CHAF1B在转录水平mRNA和蛋白水平表达降低。
4、使用IHC对CHAF1B及Ki-67进行检测，半定量结果显示CHAF1B和Ki-67表达呈显著正相关(r=0.858，P＜0.001)。
5、对于CHAF1B促进增殖的作用机制进行初步探讨，发现CHAF1B-shRNA组较NC-shRNA组比较p53表达上调、促凋亡蛋白BAK显著上调、抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调、BAK/Bcl-2比率增加、caspase-3水平升高。
结论：
1、CHAF1B在NSCLC组织高表达，高表达CHAF1B的NSCLC患者具有更短的无病生存时间和更高死亡率。CHAF1B是NSCLC患者不良预后的独立预测因子。
2、成功构建靶向CHAF1B基因的pGPU6/GFP/Neo-CHAF1B-shRNA表达载体并能够有效抑制CHAF1B基因的表达。
3、体内和体外实验均证实干扰CHAF1B能够抑制NSCLC恶性增殖，诱导细胞周期停滞，促进细胞凋亡。
4、CHAF1B与经典增殖指标Ki-67表达呈正相关，可用作增殖标志物。
5、CHAF1B可能干扰p53诱导的内源性细胞凋亡途径促使细胞凋亡，抑制肿瘤生长。
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率高，恶性程度高，导致其死亡率位居所有恶性肿瘤死亡率之首，成为世界范围内主要的公共卫生问题。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80-85%，近20年随着NSCLC基因突变图谱的绘制，NSCLC的治疗已经从经验性使用细胞毒性化疗药物转变为根据肿瘤基因分型制定的个体化治疗策略。但由于肿瘤的异质性，只有携带敏感突变的NSCLC患者临床获益。肿瘤细胞恶性增殖必然伴随活跃的DNA复制，染色质组装因子1亚基B(CHAF1B)是组蛋白分子伴侣染色质装配因子1(CAF-1)的亚基，参与DNA复制耦联的核小体组装。已有研究表明，CHAF1B在胶质瘤、前列腺癌、舌癌、乳腺癌、肾癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤组织高表达且与不良预后有关。但是，CHAF1B在NSCLC中的作用尚不明确。因此，本研究旨在了解CHAF1B在NSCLC组织表达情况、CHAF1B与临床病理指标和预后的关系以及CHAF1B对NSCLC细胞生物学行为的研究和初步的机制探讨，以识别新的驱动基因能够使更多NSCLC患者受益于靶向治疗。
方法：
1、使用免疫组织化学染色(IHC)方法检测135例NSCLC组织和癌旁组织CHAF1B的蛋白表达。另外收集27例新鲜的NSCLC组织及配对癌旁组织，使用实时定量PCR技术检测CHAF1B在转录水平上mRNA表达。对IHC半定量结果，依据时间依赖性ROC曲线确定NSCLC患者CHAF1B高表达组和CHAF1B低表达组的界值。分析CHAF1B表达高低与NSCLC患者的性别、年龄、吸烟状态、病理类型、分化程度、淋巴结是否转移、脉管是否受侵、肿瘤大小以及临床分期的关系。通过电话方式对135例NSCLC患者进行至少5年随访，对该队列患者进行生存分析。
2、通过实时定量PCR和Westernblot检测CHAF1B在人肺癌细胞系95-D，NCI-H292、A549以及人正常支气管粘膜上皮细胞系16HBE中mRNA和蛋白表达水平，筛选出CHAF1B高表达的肺癌细胞株。构建针对CHAF1B基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体，用脂质体将重组质粒转染肺癌细胞株，经G418筛选阳性克隆建立稳转细胞株。使用实时定量PCR和Westernblot法检测CHAF1B的mRNA和蛋白表达水平明确CHAF1B基因干扰效率。CCK8法检测CHAF1B对肺癌细胞株增殖能力的影响；采用克隆集落形成实验检测CHAF1B对NSCLC细胞克隆形成的影响；采用流式细胞仪检测CHAF1B对NSCLC细胞凋亡以及细胞周期的影响。
3、体内实验，将稳定转染pGPU6/GFP/Neo-CHAF1B-shRNA(CHAF1B-shRNA)和pGPU6/GFP/Neo-shNC(NC-shRNA)的肺癌细胞分别接种于裸鼠腋部皮下，建立裸鼠NSCLC皮下移植瘤模型。定期测量瘤体长径和宽径，计算瘤体体积，绘制生长曲线。在建模第40天处死裸鼠，解剖瘤体称重。应用IHC检测CHAF1B和增殖指标Ki-67蛋白表达，定量PCR检测CHAF1B的mRNA表达。
4、对于135例NSCLC的组织蜡块，使用IHC检测CHAF1B的同时，也检测增殖指标Ki-67的表达情况。并对CHAF1B和Ki-67的表达进行相关性分析。
5、为明确CHAF1B促进NSCLC增殖的初步机制，使用实时定量PCR以及Westernblot技术检测p53诱导的内源性细胞凋亡途径中p53、BAK、Bcl-2和caspase-3关键基因的表达。
结果：
1、IHC检测发现CHAF1B在正常肺组织不表达或弱表达，在NSCLC细胞核高表达。半定量分析结果显示癌组织IHC积分5.04±0.23，正常组织IHC积分0.69±0.07(n=135，P＜0.0001)。实时定量PCR分析结果同样显示NSCLC组织CHAF1B在转录水平较邻近正常组织高8.5倍，尤其鳞状细胞癌差异更显著。根据ROC曲线确定NSCLC患者CHAF1B高表达组和低表达组的界值为4.83。对患者CHAF1B表达高低与临床病理指标进行相关性分析，发现CHAF1B表达水平与性别(P=0.008)、病理分型(P＜0.001)、吸烟(P＜0.001)、分化程度(P=0.007)、临床分期(P=0.002)、肿瘤大小(P＜0.001)有关联，与淋巴结是否转移(P=0.085)、脉管是否受侵(P=0.719)、年龄(P=0.406)无关。建立临床资料与复发转移时间和生存时间数据库，绘制Kaplan-Meier曲线描述生存过程。使用log-rank检验比较CHAF1B高表达组与低表达组生存率的差异，发现低分化与中分化(x2=5.811，P=0.016)；有淋巴结转移和无淋巴结转移(x2=21.944，P＜0.001)；不同临床分期(x2=26.521，P＜0.001)；不同肿瘤大小(x2=8.553，P=0.014)；CHAF1B高表达与低表达(x2=16.716，P＜0.001)患者的生存率存在差异。运用COX比例风险回归模型发现不同临床分期、淋巴结是否转移、CHAF1B表达高低是影响NSCLC患者存活的独立危险因素，其中CHAF1B高表达患者的死亡风险是低表达患者的2.44倍。
2、采用实时定量PCR检测CHAF1B在HBE以及NSCLC细胞A549、95-D、NCI-H292的表达水平，结果显示CHAF1B在95-D细胞中表达显著增高，选择95-D细胞用于后续生物学功能研究。成功构建靶向CHAF1B基因的重组表达载体pGPU6/GFP/Neo-CHAF1B-shRNA，经验证能够有效抑制CHAF1B的表达，其中pGPU6/GFP/Neo-CHAF1B-HOMO-550对CHAF1B抑制率达70%，因此使用脂质体将其转染95-D肺癌细胞株，经G418筛选阳性克隆建立稳转细胞株。体外细胞学功能实验证明，与对照组相比，CHAF1B-shRNA组增殖能力减弱、细胞克隆形成减少、细胞凋亡增多、细胞周期S期细胞分布减少。
3、裸鼠移植瘤实验表明，CHAF1B-shRNA组较NC-shRNA组相比，移植瘤生长速度减慢，瘤体体积减小，肿瘤重量减轻；移植瘤组织CHAF1B在转录水平mRNA和蛋白水平表达降低。
4、使用IHC对CHAF1B及Ki-67进行检测，半定量结果显示CHAF1B和Ki-67表达呈显著正相关(r=0.858，P＜0.001)。
5、对于CHAF1B促进增殖的作用机制进行初步探讨，发现CHAF1B-shRNA组较NC-shRNA组比较p53表达上调、促凋亡蛋白BAK显著上调、抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调、BAK/Bcl-2比率增加、caspase-3水平升高。
结论：
1、CHAF1B在NSCLC组织高表达，高表达CHAF1B的NSCLC患者具有更短的无病生存时间和更高死亡率。CHAF1B是NSCLC患者不良预后的独立预测因子。
2、成功构建靶向CHAF1B基因的pGPU6/GFP/Neo-CHAF1B-shRNA表达载体并能够有效抑制CHAF1B基因的表达。
3、体内和体外实验均证实干扰CHAF1B能够抑制NSCLC恶性增殖，诱导细胞周期停滞，促进细胞凋亡。
4、CHAF1B与经典增殖指标Ki-67表达呈正相关，可用作增殖标志物。
5、CHAF1B可能干扰p53诱导的内源性细胞凋亡途径促使细胞凋亡，抑制肿瘤生长。