大量研究表明,药物的糖基化修饰在提高药物活性、提高生物利用度、降低毒副作用等方面发挥着至关重要的作用,而用于药物糖基化修饰的核苷酸单糖供体(包括UDP-葡萄糖,UDP-葡萄糖醛酸,UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖、UDP-芹菜糖、UDP-半乳糖醛酸)则存在含量稀少、提取繁琐和合成困难等问题,这种不易得性限制了药物糖基化的进一步研究,不利于创新药物的研制和社会可持续发展的需要。但是,合成生物学技术的出现为该问题的解决提供了新的思路和方法。依据解析生物合成途径,得到相关关键酶的信息,对相关的关键酶基因进行研究和组装,就可实现上述核苷单糖的规模化制备。我们在对上述核苷单糖的生物合成途径进行解析时发现,UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖醛酸是合成上述所有核苷单糖的前体。因此,进一步解析UDP-葡萄糖,UDP-葡萄糖醛酸的生物合成途径,并对合成途径中的相关基因进行研究,是利用合成生物学技术合成上述核苷单糖的关键。在3条核苷单糖合成途径中,因蔗糖合酶途径最短,仅需一步反应就可生成UDP-葡萄糖,而UDP-葡萄糖在其它酶的进一步催化下可以生成多种核苷单糖,在核苷单糖的生物合成途径中处于核心的地位。因此对蔗糖合酶基因进行研究可为最终的利用合成生物学技术制备核苷单糖打下良好的开端。1、蔗糖合酶基因家族的克隆及表达依据虎眼万年青转录组测序得到的数据,通过提取虎眼万年青总mRNA,逆转录得到cDNA.设计引物,利用巢式PCR克隆得到3条蔗糖合酶基因(OcSus)。利用In-Fusion原理设计引物,构建了原核表达载体。通过直接表达或与分子伴侣共表达的形式,实现了OcSus1、OcSus2和OcSus3可溶性表达。2、蔗糖合酶基因家族的功能鉴定依据蔗糖合酶催化可逆反应这一特点,分别从蔗糖合成反应方向及分解反应方向对OcSus1-3功能进行了鉴定。利用硫酸蒽酮法对合成反应方向进行功能鉴定,初步确定OcSus1-3均具有合成蔗糖的功能。对于蔗糖分解方向的反应,我们利用反相离子对色谱进行检测。并进一步通过质谱及反应产物与标准品共进样的方式对反应产物进行进一步确认,确定了OcSus1-3具有分解反应的功能。综上,OcSus1-3均具有蔗糖合酶功能。3、蔗糖合酶基因家族分解反应底物偏好性研究利用OcSus1、OcSus2和OcSus3分别对蔗糖和ADP、TDP、GDP、CDP、UDP进行催化,研究三者催化分解反应的底物偏好性。结果发现,三者均可对UDP进行催化,此外OcSus1还可对TDP进行催化,但是反应效率低于以蔗糖和UDP为底物的反应效率。4、蔗糖合酶基因家族分解反应酶学性质研究OcSus1-3催化蔗糖分解反应的最适温度,最适pH不尽相同。其中,OcSus1和OcSus3催化蔗糖分解反应的最适温度均为50℃,而OcSus2为37℃。对于催化蔗糖分解反应的最适pH, OcSu s1和OcSus2均为7.0,而OcSus3为5.0。此外,我们还测定了不同浓度二价金属离子对OcSus1-3催化蔗糖分解反应的影响,除Ca2+对三者具有一定的促进作用外,其余二价金属离子均产生了一定的抑制作用。我们还对OcSus1-3催化蔗糖分解方向的酶促动力学参数进行了测定。结果表明,OcSus1、OcSus2和OcSus3勺UDP的Km值均低于蔗糖的Km值,即三者对UDP的亲和力均高于蔗糖。此外OcSus2在三者之中对UDP的亲和力最高,而OcSus1则是在三者之中对蔗糖的亲和力最高的,并且OcSus1的Vmax最高,说明其在三者中的催化效率较高。5、蔗糖合酶基因家族的表达模式研究利用RT-qPCR的方法,通过检测OcSus1-3在O. caudatum不同组织中的表达水平,研究了OcSusl-3的表达模式,从而进一步推断三者在O. caudatum可能具有的生理功能。研究结果表明,OcSus1和OcSus2可能负责O. caudatum中OCAP-2-1, OCAP-2-2, OCAP-3-1和OCAP-3-3这类含葡萄糖的多糖的生物合成；OcSus3则可能在植物生长发育过程中发挥着一定的作用。