第一部分血清sgp130与性激素在男性冠心病患者中的相关性研究研究背景与目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary Atherosclerotic Disease,CAD）是多种因素所致的慢性炎症性疾病,C反应蛋白（C Reactive Protein,CRP）是其重要的危险因子,其上游炎症因子白细胞介素6（Interleukin 6,IL-6）可诱发血管内皮损伤,促进粥样硬化斑块的形成,是心血管疾病的独立风险因子。游离型的糖蛋白130（Soluble glycoprotein 130,sgp130）是IL-6 Trans信号通路天然的拮抗剂,能抑制IL-6诱导的炎症反应,发挥抗动脉粥样硬化作用。此外,性激素（主要是睾酮和雌二醇）可不同程度的抑制粥样斑块形成过程中的炎症反应。本部分内容旨在研究男性CAD患者血清sgp130水平和睾酮、雌二醇及二者比例的关系,为雌雄激素协同发挥抗动脉粥硬化作用提供理论基础。研究方法:1.收集武汉大学人民医院心血管内科因胸闷胸痛症状入院的男性患者376例,根据冠脉造影结果分为CAD组（254例）和对照组（122例）。2.ELISA检测两组患者血清IL-6、游离型IL-6受体α（Soluble IL-6 receptorα,s IL-6Rα）和sgp130水平。3.全自动化学发光免疫分析仪检测血清睾酮和雌二醇的水平。4.全自动生化分析仪检测血清超敏CRP（hs-CRP）及其他常规生化项目。5.原代脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）水平研究睾酮和雌二醇对sgp130分泌的调控作用。研究结果:1.与对照组比较,男性CAD患者血清sgp130、睾酮、雌二醇水平及睾酮/雌二醇比值均降低（均P<0.05）。2.Pearson相关性分析表明,男性CAD患者血清sgp130与睾酮、雌二醇均呈正相关（r=0.295、0.338,均P<0.001）。3.多重线性回归分析显示,男性CAD患者血清sgp130与雌二醇及睾酮/雌二醇比值均呈正相关（β=0.450、0.257,均P<0.01）。4.睾酮和雌二醇共同作用可显著上调原代HUVECs培养上清中sgp130的水平（P<0.05）。研究结论:本部分结果证实,男性CAD患者血清低水平的sgp130与性激素相关,表明性激素水平降低或失衡时,可影响sgp130的水平。因此,通过调节性激素再平衡,或可上调sgp130,作为CAD治疗的一个新方法。第二部分雌雄激素协同作用对IL-6/gp130信号通路的抑制效应及其机制研究研究背景与目的:动脉粥样硬化是冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary Atherosclerotic Disease,CAD）潜在的病理基础,炎症诱导的血管内皮细胞损伤是其发生的重要因素之一。白细胞介素6（Interleukin 6,IL-6）是机体神经-内分泌-免疫调节网络的重要成员,在炎症反应中起核心调节作用。糖蛋白130（Glycoprotein 130,gp130）是IL-6的信号转导受体,而性激素可以通过其受体影响gp130蛋白的水平和功能,阻断下游的信号传导,抑制IL-6相应的生物学效应。此外,性激素与CAD的发病机制密切相关。本部分内容在原代人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）水平,探讨雌雄激素协同作用对IL-6诱导炎症反应的抑制作用,检测gp130蛋白及其下游信号通路JAK/STAT3、PI3K/AKT、MEK/Erk1/2水平的变化,并深入探讨雌雄激素协同作用抑制IL-6/gp130信号通路的可能机制。研究方法:1.在HUVECs水平,用IL-6和游离型IL-6受体α（Soluble IL-6 Receptorα,s IL-6Rα）共同作用诱导gp130表达及其下游信号通路的激活,并用单纯雌二醇、单纯睾酮和睾酮/雌二醇协同作用进行治疗。2.蛋白免疫印迹法检测细胞总蛋白中gp130蛋白及其下游信号通路JAK/STAT3、PI3K/AKT、MEK/Erk1/2水平的变化。3.ELISA检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factorα,TNF-α）、单核细胞趋化因子1（Monocyte Chemotactic Protein 1,MCP-1）的浓度。4.细胞免疫荧光法检测HUVECs中细胞间黏附分子1（Intercellular Adhesion Molecule 1,ICAM-1）的表达水平。5.利用Crispr-cas9技术构建gp130-/-HUVECs细胞,确定雌雄激素协同作用是否通过gp130蛋白起作用。6.采用免疫共沉淀技术,探讨雌雄激素受体与gp130蛋白之间是否存在直接作用。7.用激素受体抑制剂和激动剂验证雌雄激素是否通过其受体调控gp130蛋白表达。研究结果:1.在HUVECs中,IL-6和s IL-6Rα共同作用24小时后,可明显上调gp130蛋白的水平,并激活下游信号分子STAT3蛋白,抑制PI3K/AKT和MEK/Erk1/2信号通路的激活,当给予睾酮/雌二醇联合治疗后,可明显逆转IL-6的上述生物学效应。2.在炎症因子检测中,雌雄激素协同作用可显著抑制IL-6和s IL-6Rα共同作用诱导的TNF-α、MCP-1及ICAM-1水平上调。3.在gp130-/-HUVECs中,IL-6和s IL-6Rα共同作用24小时不再抑制PI3K/AKT蛋白的激活,但给予睾酮/雌激素联合作用仍可显著激活PI3K/AKT信号通路。4.在gp130-/-HUVECs中,IL-6和s IL-6Rα共同作用24小时可抑制MEK/Erk1/2蛋白的激活,但给予睾酮/雌激素联合作用不能逆转IL-6和s IL-6Rα共同作用对MEK/Erk1/2信号通路的抑制作用。5.免疫共沉淀实验结果显示,雌激素受体（Estrogen Receptor,ER）α和ERβ可与gp130相互作用,雄激素受体（Androgen Receptor,AR）可与AKT、SOCS3相互作用。6.ERα和ERβ抑制剂可显著减弱雌二醇对gp130蛋白的抑制效应,ERα和ERβ激动剂可显著抑制gp130蛋白的表达。研究结论:本部分结果显示,雌雄激素协同作用可显著抑制gp130蛋白的表达,并抑制其下游信号分子STAT3的激活,同时激活PI3K/AKT和MEK/Erk1/2信号通路,抑制炎症因子TNF-α、趋化因子MCP-1及黏附分子ICAM-1的水平。其可能的机制是,睾酮和雌二醇通过其相应的受体抑制gp130蛋白的水平,并影响gp130及其下游信号分子的功能,从而调节IL-6/gp130信号通路的生物学效应。第三部分雌雄激素协同作用调节ApoE-/-小鼠IL-6/gp130信号通路的抗动脉粥样硬化机制研究研究背景与目的:性别和年龄作为冠心病（Coronary Atherosclerotic Disease,CAD）的独立危险因素,提示性激素与CAD的发生具有相关性。然而,单纯的雌激素替代治疗（Estrogen Replacement Therapy,ERT）和雄激素替代治疗（Testosterone Replacement Therapy,TRT）均因其严重的不良反应而难以应用到临床。近年来,神经-内分泌-炎症网络学说为CAD的病理生理过程做出了新的解释,权衡雄激素和雌激素在心血管系统的利弊,雌雄激素的平衡状态对于维持机体正常的生理功能有重要作用。此外,白细胞介素6（Interleukin 6,IL-6）是重要的促炎症因子,通过其受体糖蛋白130（Glycoprotein 130,gp130）激活下游信号通路,进一步促进趋化因子和粘附分子的表达,促使单核细胞向血管内膜趋化,诱发炎症反应,造成血管内膜损伤。前期研究结果已证实,IL-6 Trans信号通路的天然抑制剂游离型糖蛋白130（Soluble glycoprotein 130,sgp130）在男性CAD患者血清中的降低与性激素密切相关,同时在细胞学中证实雌雄激素协同作用可下调gp130蛋白,调节其下游信号通路,抑制IL-6诱导的炎症反应。本部分内容旨在性激素低水平ApoE-/-雄性小鼠模型中,进一步研究雌雄激素协同作用对IL-6/gp130信号通路的调节作用及抗动脉粥样硬化的效应,为CAD的预防和治疗提供新策略。研究方法:1.8周龄雄性ApoE-/-小鼠通过切除双侧睾丸和附睾建立性激素低水平动物模型,两周后开始给予高脂饮食造动脉粥样化模型,同时给予外源性睾酮、雌二醇恢复性激素水平,共进行四个月。2.造模结束后,眼球摘除法取血,分离血清,ELISA检测血清总睾酮、雌二醇、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor Receptorα,TNF-α）和IL-6水平。3.取各组小鼠主动脉弓至髂总动脉处的主动脉,进行整体油红O染色,观察各组小鼠主动脉的粥样斑块形成情况。4.切取各组小鼠主动脉和主动脉瓣,进行HE染色和油红O染色,观察各组小鼠血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增生及斑块内脂质沉积情况。5.取整体主动脉,提取总蛋白,蛋白免疫印迹法检测gp130蛋白水平及其下游信号通路JAK/STAT3、PI3K/AKT及MEK/Erk1/2的活化状态,检测黏附分子ICAM-1的水平。研究结果:1.小鼠整体主动脉和主动脉瓣油红O染色结果显示,与造模组比较,单纯睾酮和单纯雌二醇治疗组小鼠主动脉的粥样斑块数量和斑块内脂质沉积有所减少,而睾酮/雌二醇协同治疗组小鼠主动脉的斑块数量和斑块内的脂质沉积显著减少。2.小鼠主动脉瓣HE染色结果显示,与造模组比较,单纯的雌二醇治疗组小鼠血管内皮细胞损伤和血管平滑肌细胞增生情况略有改善,单纯的睾酮治疗组小鼠血管动脉粥样斑块的稳定性有一定的改善,而睾酮/雌二醇协同治疗组小鼠血管内皮细胞完整、平滑肌细胞增生较少、粥样斑块的稳定性较好。3.炎症因子检测结果显示,与造模组比较,雌雄激素协同作用可以显著抑制TNF-α和IL-6的水平（均P<0.05）,而单独的雌二醇或睾酮治疗不能下调TNF-α、IL-6。4.蛋白免疫印迹法检测小鼠整体主动脉蛋白结果显示,与造模组比较,睾酮/雌二醇协同作用组小鼠主动脉gp130、p-gp130、p-STAT3、ICAM-1蛋白水平显著降低,PI3K/AKT和MEK/Erk1/2信号通路显著激活（均P<0.05）。研究结论:本部分结果显示,雌雄激素协同作用可抑制ApoE-/-小鼠体内炎症因子的水平,抑制主动脉粥样斑块的形成,延缓动脉粥样硬化疾病的进程。同时,在动脉粥样硬化小鼠模型中证实,睾酮/雌二醇协同作用可显著下调ApoE-/-小鼠主动脉gp130蛋白的水平,并抑制gp130和STAT3磷酸化,激活PI3K/AKT和MEK/Erk1/2信号通路。因此,动物学实验进一步证实,雌雄激素协同作用可通过下调gp130蛋白水平,调节其下游信号通路,发挥抗动脉粥样硬化作用,为雌雄激素协同作用治疗动脉粥样硬化提供了靶标和理论依据。