重金属汞单克隆抗体制备与免疫检测方法建立

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重金属是有毒和对环境有持久污染的物质,它并不像碳源污染物那样能完全降解为无毒的物质,而仅仅是通过一些有限的生物的或化学过程进行转化。这些转化对一些特定的金属只是限制其毒性或可溶性,一些金属通常竞争过程重新循环,最终又恢复到原来的毒性状态。在环境中金属离子长时间结合在土壤中或沉淀物中,这些结合的金属除了对下层生长的动物的外都相对无毒。但天气的变化、土壤或水中PH值或环境的结合都能够使金属发生移动,从而大大提高了它们的可利用性和高效的毒性。汞是毒性最强的重金属元素之一,目前汞的检测方法仍然依赖传统仪器,但免疫检测方法具有检测快速、费用低、易于操作、易懂、简单易携、而且高灵敏性和可选择性等特点,近年来日益受到国内外广泛的关注。本研究以匙孔血蓝蛋白(KLH)与汞离子通过双功能螯合剂异硫氰基-苯甲基-乙二胺四乙酸(ITCBE)偶联,获得完全抗原KLH-ITCBE-Hg(Ⅱ),以该抗原免疫BALB/C小鼠,应用杂交瘤技术,经ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化,获得了5株可稳定分泌抗重金属汞的杂交瘤细胞株(E/H9、E/B2、1/F11、1/H7和B/B11)。所分泌的抗体均为IgM、κ型,其中杂交瘤细胞株E/H9、1/F11和B/B11细胞培养上清液效价分别达1:640、1:320、1:160,腹水效价分别达1:6400、1:3200、1:6400。B/B11的亲和常数为2.981×108L/mol,特异性试验表明:B/B11与其它金属离子均无明显交叉反应,具有较高的特异性。本研究成功制备的高亲合力和高特异性的抗汞单克隆抗体,为建立农产品和环境中重金属汞的快速免疫检测技术奠定了基础。选取一株杂交瘤细胞细胞B/B11所分泌的抗体进行研究。通过对盐离子强度等四个影响因子的研究建立了ELISA检测体系,其检测条件为:包被抗原BSA-GSH-Hg(Ⅱ)浓度0.9μg/mL,细胞培养上清液2倍稀释,1%明胶作为封闭物,反应基质HBS中离子强度为0.15mol/L,pH值为5.5;以Logit(B/B0)作纵坐标与Hg2+浓度(mM)的负对数值作横坐标建立检测曲线,在0.00001-0.01mmol/L范围内呈显著线性关系,检测方程为Y=1.6723X-4.6806,相关系数达0.994,检测极限值为9.105×10-6mmol/L。批内和批间变异系数分别为1.2%和4.7%,超纯水、自来水、池塘水样和小青菜样品中的添加回收率分别为102.21%、96.92%、103.23%和87.12%。
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