烯醇酶又称磷酸丙酮酸水合酶,在许多有机体中属于高表达蛋白,是糖代谢中的关键酶,催化2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。近来研究表明烯醇酶除了具有糖代谢功能之外,在许多生理及病理过程中发挥重要作用。细胞表面的烯醇酶可以与纤溶酶原结合,使纤溶酶原构型改变,从而更易被激活为纤溶酶。纤溶酶是一种血清蛋白,在细菌表面被激活后引发不受控的蛋白水解,降解纤维和组织使感染扩散。福赛斯坦纳菌等牙周病致病菌的烯醇酶对纤维连结蛋白的降解参与了牙周炎中牙龈附着的丧失。此外,烯醇酶表达量及酶活性的升高有助于细菌在含氟环境中生存,降低氟化物的防龋效果。因此,作为一种多功能蛋白,烯醇酶在口腔医学领域的研究中还需要更深入的研究。变形链球菌是龋病的主要病原菌,氟化物是广泛应用的防龋制剂。氟化物的长期大量应用导致了耐氟菌株的选择性生长。变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株相比,不仅具有更强的氟耐受能力和致龋能力,同时基因组学及蛋白质组学均有改变。其中eno不仅发生了单个碱基的错义突变(g.1184373bpC>T,p.Thr>Ile);并且其编码的蛋白表达量上调。说明烯醇酶在变形链球菌耐氟菌株中发挥关键作用。为进一步研究eno基因在变形链球菌耐氟菌株耐氟及致龋中发挥的作用,本实验利用重叠延伸基因拼接技术构建了eno基因插入失活的同源重组DNA线性片段,将抗性筛选基因卡那霉素编码序列插入到eno基因的开放阅读框架中,使细菌无法表达出有功能的烯醇酶从而达到eno基因敲除的目的。并且成功将构建好的同源重组片段与pEASY-Blunt平末端载体连接,以便片段的保存和扩增。通过电转化的方法将扩增并纯化的片段导入变形链球菌耐氟菌株感受态细胞,利用卡那霉素抗性及菌液PCR筛选鉴定出同源重组片段转化成功的变形链球菌耐氟菌株。本实验成功构建了变形链球菌耐氟菌株eno基因敲除株,为明晰eno基因在细菌致病及耐氟等方面发挥的作用及其调控通路,阐明口腔细菌耐受环境压力的机制奠定了基础。eno基因敲除变形链球菌耐氟菌株与未敲除的耐氟菌株之间的表型差异、转录组测序比对、该基因相关的上下游基因表达量的改变等可作为后续的研究方向。