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随着软骨再生医学的发展,通过组织工程化软骨来修复软骨缺损取得了很大的成功。现有技术条件下再生出类似软骨的组织还远远不能满足临床需求,因此如何实现再生软骨组织的“功能化”,即具有类天然软骨的结构、组成和功能,成为软骨组织工程面临的重大挑战。 再生软骨组织的构建大多需要支架材料、种子细胞、生长因子和理化因素的有机结合,其中支架材料的功能化至关重要。支架材料的功能化是指材料能够给加载在其中的细胞提供合适的生物活性信号,使细胞维持良好的功能状态,并同时能够在组织的再生过程中随着环境的变化做出相应的响应。具体说来应具备如下特征:1.力学响应性:支架材料应像正常软骨组织一样具有足够强度的粘弹性,能够对外界的力学刺激进行适当的响应;2.调控细胞的粘附与增殖:具有特定的的生物活性成份,提供细胞的粘附位点;3.调控种子细胞的迁移与积聚:具有环境响应性,可以主动随着环境的变化释放活性成份,调控细胞的迁移;4.调控细胞外基质的有序排列:诱导分泌细胞外基质的排列与分布,使其形成类似软骨组织细胞外基质的排列结构;5.能够紧密与周围组织结合在一起,最终再生出具软骨分层结构的功能化软骨组织。因此在体外仿生并制备出具有上述功能的支架材料,对于再生软骨组织的功能化具有十分重要的意义。 本论文从制备具力学响应的仿生支架材料入手:首先将具有高弹性的Poly(L-lactide-co-ε-caprolactone)(PLCL)高分子材料模拟软骨组织中具有抗拉伸的弹性二型胶原网络,壳聚糖模拟软骨组织中具有高吸水性能并抵抗外界压力的蛋白聚糖分子,再通过己二胺胺解交联的方式进行化学修饰来制备壳聚糖/PLCL多孔支架。通过力学性能测试(应力应变测试、蠕变实验、应力松弛实验等)表明该支架材料具有与软骨组织类似的粘弹性,但压缩杨氏模量与正常软骨组织相比仍然相差一个数量级。将C28I2软骨细胞系和猪原代软骨细胞分别种入支架材料中,细胞的粘附与增殖实验、荧光共聚焦显微镜观察细胞的形态、荧光定量PCR以及免疫组织染色结果证明壳聚糖修饰的PLCL多孔支架材料提高了形成软骨组织的能力。 加入PHBV微球提升力学性能并改变材料内部微观形貌诱导细胞积聚:引入poly(β-hydroxybutyrate-co-β-hydroxyvalerate)(PHBV)微球可以增强弹性PLCL多孔支架材料的压缩杨氏模量。采用乳化剂挥发法制备了平均粒径为36μm的PHBV微球,进而成功制备了不同浓度梯度的PHBV微球/PLCL复合支架材料。应力应变测试表明40%PHBV微球/PLCL复合支架材料的杨氏模量显著高于PLCL支架,但仍低于正常软骨组织。原代软骨细胞体外种植实验表明,PHBV微球/PLCL支架材料中细胞的形态、粘附和增殖能力、GAG及胶原产量与在PLCL支架中没有显著的差异。但是裸鼠皮下移植实验表明新型多孔支架材料能够促进软骨细胞分泌细胞外基质。上述结果表明,PHBV微球的成功引入,为生物活性因子的定点释放提供了靶点,并能够提供生长因子缓释的研究模型。此外,我们还发现PHBV微球可以改变多孔材料的内部形貌并具有调控细胞迁移和积聚的潜能。 制备具生物活性的多孔微球:为了优化出具有调控软骨细胞迁移和积聚的功能性微球的参数,我们采用一种修饰的双乳液溶剂挥发法制备出具有一定大小和孔径的多孔高分子微球,并对影响多孔高分子微球形貌的参数(如溶剂种类、聚酯类高分子种类、高分子的分子量以及高分子溶液的浓度等)进行了调控,并在此基础上通过乙二胺胺解、戊二醛交联的手段成功将明胶高分子交联到了多孔Poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)微球的内部。软骨细胞加载实验表明明胶修饰的多孔PLGA微球显著提高了细胞加载的效率,同时可观察到软骨细胞可以进入多孔微球的内部。 在生物材料内部调控细胞积聚:最后为了验证制备的功能性多孔PLGA微球对于软骨细胞的迁移和积聚的能力,将明胶修饰的PLGA高分子微球引入到琼脂糖水凝胶体系中,与单独琼脂糖水凝胶相比,细胞加载一天后,大约83%的细胞已经明显积聚在活性多孔微球的周围,而在琼脂糖水凝胶中细胞仍然呈现单独分布的状态。该实验首次将活性多孔微球应用到其他生物材料中主动调控细胞的积聚,该实验的成功不仅能够为今后的细胞积聚提供研究模型,并且能够应用到促进软骨再生的功能性支架材料中,对研究功能性支架材料具有十分重要的指导意义。 综上,我们建立了一种功能性微球在软骨组织工程支架材料中的应用体系,通过深入研究发现该体系对软骨细胞的活性和功能具有积极的影响。这对利用组织工程技术提高软骨组织修复质量具有十分重要的指导意义。