OPC移植治疗脊髓损伤中microRNA表达谱分析及miR-363的功能研究

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:peiyhpyh
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[目的]本研究利用小鼠胚胎成纤维细胞源性的多能干细胞(Induced pluripotent stem cell ipsC)分化的少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte precursor cell OPC)移植治疗大鼠脊髓钝挫性损伤(Spinal cord contusive injury SCC),探讨其对大鼠脊髓损伤的影响。[方法]建立大鼠脊髓钝挫伤损伤模型,造成大鼠脊髓损伤。通过BBB评分及MRI影像学检查,评估模型是否建立成功。利用免疫荧光染色鉴定小鼠胚胎成纤维细胞源性的ipsC是否分诱导化成OPC细胞。移植OPC细胞至SCC大鼠损伤脊髓,通过BBB评分和机械痛觉阈值检测,探讨其对脊髓损伤大鼠的运动和感觉功能的影响。[结果](1)BBB评分结果显示,SCC组大鼠BBB评分明显比Sham组大鼠低,说明钝挫伤造模成功,脊髓损伤损害了大鼠运动功能,MRI结果显示:SCC组的损伤部位水肿明显,脊髓形态紊乱且有组织有部分液化,证明大鼠钝挫伤脊髓损伤模型成功建立。(2)GFP-OPC细胞培养在含有PDGF的基础OPC培养基中,几乎所有细胞呈现出OPC细胞的典型形态,证明小鼠胚胎成纤维细胞源性的多能干细胞能分化为OPC细胞。(3)BBB评分结果发现,从术后第1天到第28天,除了术后第3天,OPC组BBB评分明显高于Medium对照组织(P<0.05),说明OPC细胞移植对SCC大鼠的运动功能有一定改善。(4)在移植后1天和3天,OPC组和Medium组脊髓钝挫伤大鼠的机械疼痛阈值差异不明显。然而,在移植后7天,14天,21天和28天,与Medium组比,OPC组的机械疼痛阈值均升高(P<0.05)。[结论]利用BBB评分及MRI影像学检查,证明大鼠脊髓钝挫伤模型成功建立。免疫荧光染色结果表明小鼠胚胎成纤维细胞源诱导性ips细胞在合适的培养基中培养能够分化为OPC细胞。OPC细胞移植对脊髓钝挫伤大鼠的运动和感觉功能有一定改善。[目的]利用microRNA芯片技术分别对假手术(Sham)组,脊髓钝挫伤手术(SCC)组,OPC细胞移植组(OPC),培养液移植对照组(Medium)大鼠脊髓中的差异表达microRNAs进行检测,并通过生物信息学方法对差异表达的microRNAs进行靶基因功能及通路预测,探讨microRNAs可能参与OPC细胞移植治疗大鼠脊髓钝挫性损伤的分子调控机制。[方法]移植术后7天,将SCC组、Sham组、OPC组和Medium组大鼠的T10节段脊髓组织取出用于microRNA芯片分析。利用基因本体论(GO)对差异表达microRNA的靶基因进行功能分析。利用KEGG pathway对差异表达microRNA的靶基因进行通路分析。[结果](1)microRNA芯片结果发现,与Sham组比,SCC组脊髓总共有217个差异表达的microRNAs,其中包括62个上调的microRNAs,155个下调的microRNAs。与Medium组相比,OPC组脊髓总共有45个差异表达的microRNAs,其中包括40个上调的microRNAs,5个下调的microRNAs。SCC组与Sham组比上调的microRNA和OPC组与Medium比上调的microRNA有3个相同的microRNAs;SCC组与Sham组比上调的microRNA和OPC组与Medium比下调的microRNA有3个相同的microRNAs;SCC组与Sham组比下调的microRNA和OPC组与Medium比上调的microRNA有24个相同的microRNAs;SCC组与Sham组比和OPC组与Medium比无同时下调的microRNA。(2)SCC组与Sham组比上调的microRNA对应靶基因特有富集的GO有33条;SCC组与Sham组比下调的microRNA对应靶基因特有富集的GO有90条;OPC组与Medium组比上调的microRNA对应靶基因特有富集的GO有323条;OPC组与Medium组比下调的microRNA对应靶基因特有富集的GO有105条;(3)SCC组与Sham组比上调的microRNA对应靶基因特有富集的GO有3条;SCC组与Sham组比下调的microRNA对应靶基因特有富集的GO有9条;OPC组与Medium组比上调的microRNA对应靶基因特有富集的GO有10条;OPC组与Medium组比下调的microRNA对应靶基因特有富集的GO有2条。[结论]与Sham组比,SCC组脊髓总共有217个差异表达的microRNAs,其中包括62个上调的microRNAs,155个下调的microRNAs。与Medium组相比,OPC组脊髓总共有45个差异表达的microRNAs,其中包括40个上调的microRNAs,5个下调的microRNAs。SCC组与Sham组比,OPC组与Medium组比差异表达的microRNA有共同的,也有各自特有的靶基因富集的GO和信号通路。[目的]验证OPC组与medium组相比表达上升的前十个MircorRNAs和下调的五个MircorRNAs表达;探讨miR-363对体外培养脊髓神经元细胞的功能;并探讨miR-363与DCLK1的调控关系。[方法]利用Q-PCR验证OPC组与medium组相较表达上升的前十个MircorRNAs和下调的五个MircorRNAs表达。体外培养脊髓神经元细胞并转染miR-363 mimics和miR-363 inhibitor,研究miR-363对脊髓神经元的作用。利用及双荧光素酶报告实验及Q-PCR实验验证miR-363与DCLK1的调控关系。[结果](1)Q-PCR结果表明ro-miR-375-3p和ro-miR-1-3p在OPC组脊髓组织中的相对表达量高于其在Medium组中的表达,与microRNA芯片结果一致;ro-miR-363,ro-miR-449a-5p和ro-miR-3074在OPC组脊髓组织中的相对表达量低于其在Medium组中的表达,结果与microRNA芯片结果一致。(2)在体外,miR-363低表达能够增加神经元的数量,增大神经元的面积,增加轴突长度,而miR-363过表达导致相反的结果。(3)双荧光素酶报告实验结果表明DCLK1是miR-363的靶基因。(4)与Normal组比,miR-363 mimics组原代脊髓神经元细胞中DCLK1 mRNA的相对表达量降低;与Normal组比,miR-363 inhibitor组原代脊髓神经元细胞中DCLK1 mRNA的相对表达量增加。[结论]ro-miR-375-3p,ro-miR-1-3p,ro-miR-363,ro-miR-449a-5p 和 ro-miR-3074在OPC组与medium组间差异表达。在体外,miR-363低表达能够增加脊髓神经元的数量,增大神经元的面积,增加轴突长度,而miR-363过表达导致相反的结果。并且在原代脊髓神经元中miR-363能够调控DCLK1的表达,双荧光素酶报告证实DCLK1是miR-363的靶基因,说明miR-363通过DCLK1的表达从而调控原代脊髓神经元的生长和增殖。
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