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研究背景与目的:糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是独立于冠状动脉疾病,是危害糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者健康和生命的重要并发症。世界卫生组织相关数据表明:目前全球有超过4亿的DM患者,有22%DM患者合并心力衰竭,并且每年约有3.3%DM患者逐步发展为心力衰竭,未来DCM将会导致50%DM患者死亡。DCM的发生发展涉及多种机制,包括线粒体功能障碍,氧化应激增多,心肌胰岛素代谢信号受损,晚期糖基化终产物升高,炎症,心脏自主神经病变,微血管功能障碍等多种机制,而线粒体功能受损被认为是上述途径激活且持续存在的核心环节。DM病理状态下NADPH氧化酶过度激活,线粒体呼吸链产生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),而大量ROS的蓄积可破坏机体内氧化还原稳态,进一步加重线粒体功能障碍,形成一个恶性循环,促进DCM的发生发展。此外,正常心肌的工作依靠线粒体ATP产能,然而在高糖情况下可诱导心肌细胞中的ATP合成酶破坏,线粒体超氧化物的产生和心肌细胞过度凋亡,导致心肌重塑,引起心脏功能障碍。线粒体是真核细胞细胞器,通过氧化磷酸化在能量代谢中发挥重要作用,线粒体可将胞质中的前体蛋白引导入线粒体内,而位于线粒体外膜的线粒体外膜转化酶(Translocase of the outer mitochondrial membrane,Tom)复合物对细胞质中前蛋白具有初步识别作用,其中线粒体外膜转化复合物亚基70(Translocase of the outer membrane,Tom70)是Tom复合体的主要受体蛋白之一,是识别大量代谢物载体(如ATP/ADP或磷酸盐载体)前体的主要输入受体。目前相关研究表明,Tom70在改善贫血、延缓阿尔兹海默症病情进展、治疗肥厚型心肌病及缺血性心肌病等多种疾病中发挥重要作用。而Tom70识别前体蛋白的作用受代谢信号开关的调节,在高糖状态下,蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase,PKA)可使Tom70磷酸化,直接调控其输入受体,从而达到调控代谢产物载体输入速率的作用。他人研究证实,抑制Tom70能加重心肌线粒体损伤,产生过量ROS,从而起到加重缺血性心肌病再灌注损伤的作用。由此我们提出猜想,在高糖状态下,Tom70磷酸化水平下降、表达减少,而这种改变加重线粒体损伤,增加氧化应激水平,促进DCM的发生和发展。根据上述理论假设,我们将利用瘦素受体敲除(db/db)小鼠及相应的野生型(Wild type,WT)小鼠,以高糖高脂构建小鼠心肌细胞模型,同时结合分子生物学技术、形态组织技术,深入亚细胞水平进行线粒体形态及功能评价,利用小动物心脏超声评价心脏结构和功能等开展相关的研究工作,拟阐明Tom70在DCM的作用,初步探讨相关机制,以期为DCM治疗及预防提供新的干预靶点。材料与方法:本实验通过Tom70 siRNA干扰技术抑制Tom70表达及慢病毒干预过表达Tom70构建相关细胞实验及动物实验模型。细胞实验采用细胞流式检测心肌细胞的凋亡情况。免疫印迹(Western blot,WB)检测凋亡相关蛋白caspase3、caspase9表达水平,荧光染料Dihydroethidium(DHE)检测超氧阴离子水平,ELISA试剂盒检测ROS水平,线粒体ATP试剂盒检测ATP水平,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)水平。整体动物试验中,我们将利用血糖仪检测鼠尾空腹血糖,ELISA试剂盒检测血浆胰岛素水平,免疫组化及WB检测Tom70表达情况,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测Tom70、ANP、BNP转录情况,H&E染色及麦芽凝集素(Wheat germ agglutinin,WGA)染色检测心肌的组织形态,Masson染色检测小鼠心肌纤维化程度,小动物心脏超声检测左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室缩短分数(Left ventricular fractional shortening,LVFS)及二尖瓣口舒张早期最大血流速度(E值)与舒张晚期最大血流速度(A值)的比值(E/A值),透射电镜观察心肌线粒体形态,线粒体ATP试剂盒检测ATP水平,JC-1试剂盒检测MMP水平,TUNEL染色观察心肌凋亡小体形成情况。结果:1.糖尿病心肌病变组织Tom70表达受抑制与WT小鼠相比,db/db小鼠鼠尾空腹血糖与血浆胰岛素水平明显升高、胰岛素敏感性明显下降、体重升高、心脏平均重量增加,心肌细胞平均横截面积增大,心肌纤维化程度增加(P<0.01),同时发现心肌组织中的Tom70基因转录及蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。2.抑制Tom70表达可加重糖尿病心肌病变与WT(T siRNA)小鼠相比较,db/db(T siRNA)组小鼠心肌肥厚及心肌纤维化程度明显增加,ANP、BNP转录水平明显升高,LVEF、LVFS及E/A明显下降(P<0.01);而与db/db(T scRNA)小鼠相比,db/db(T siRNA)组可进一步加重上述指标(P<0.01)。3.下调Tom70加重高糖-高脂介导的心肌细胞氧化应激损伤与凋亡与Normal(T siRNA)组相比,HG-HF(T siRNA)组细胞凋亡水平及凋亡相关分子Caspase3、Caspase9表达水平显著增加,超氧阴离子及ROS水平明显升高,线粒体功能明显受损(P<0.01)。与HG-HF(T siRNA)组相比,HG-HF(T scRNA)组细胞凋亡、氧化应激水平及线粒体功能情况明显好转(P<0.01)。4.过表达Tom70减轻高糖-高脂介导的心肌细胞凋亡,减轻糖尿病心肌病变在细胞水平上,与Normal(Tom70)组相比,HG-HF(Tom70)组细胞凋亡及凋亡相关分子Caspase3、Caspase9表达显著增高(P<0.05或P<0.01);与HG-HF(GFP)组相比,慢病毒转染Tom70后能明显减少凋亡(P<0.01)。在动物水平上,与WT(GFP)组相比,db/db(GFP)组线粒体形态破坏、线粒体ATP及MMP水平明显抑制、心肌凋亡增加、心肌肥厚及心肌纤维化程度增加,LVEF及LVFS明显降低(P<0.01),而Tom70过表达后,可明显改善db/db小鼠上述情况(P<0.05或P<0.01)。结论:1.db/db小鼠心脏Tom70表达水平下降;抑制Tom70表达,可加重HG-HF介导线粒体功能障碍、氧化应激及细胞凋亡,从而进一步加重DCM。2.过表达Tom70,可减轻氧化应激与凋亡水平,修复线粒体形态与功能,从而起到改善DCM的作用。