目的:癫痫(epilepsy, EP)是神经系统最常见的慢性反复发作性疾病之一。是由各种原因引起的脑功能障碍综合征,是脑细胞群异常超同步化放电而引起的发作性的、突然的、暂时的脑功能紊乱。癫痫最显著的临床特征是长期反复的不同形式的痫性发作和脑电图的痫性改变。在临床中,抗癫痫药物(antiepileptic drugs, AEDs)是癫痫治疗的主要手段,有一部分癫痫患者需要长期甚至终生服用抗癫痫药物。很多癫痫患者常伴有学习记忆减退,有研究表明30%-40%的癫痫患者存在认知功能障碍。影响癫痫患者生存质量的因素除痫性发作的类型、频率、发病年龄之外,抗癫痫药物的使用也是一个重要因素。一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种新的细胞间信息交换载体,是中枢神经系统细胞间信使分子,具有第一信使和神经递质功能。NO对神经元具有保护和损伤的双重作用,生理剂量的NO对神经系统的活动是至关重要的,但过量的NO对神经系统又会产生明显的毒性作用。NO广泛参与机体的多种生理和病理作用,它在癫痫及学习记忆中均起有重要作用。在中枢神经系统中,神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide sythase, nNOS)是一氧化氮合成的限速酶,nNOS主要存在于神经元中,在多数情况下低水平表达,机体一旦受到病理性刺激,nNOS即大量表达,生成大量NO产生毒性作用。迄今为止,nNOS与癫痫后及服用AEDs后认知功能损伤关系的研究甚少。本实验利用戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)诱导出慢性癫痫动物模型,将动物分组,并分别给于脑力隆和拉莫三嗪灌胃处理,通过脑电图(electroencephalogram, EEG)、Morris水迷宫试验(Morris water maze test, MWMT),探讨两种药物对痫性发作的控制情况和对癫痫大鼠学习记忆能力的影响;用免疫组织化学染色技术,观察nNOS在海马神经元中表达的变化情况,为进一步研究抗癫痫药物对癫痫患者认知功能影响的机制提供依据。方法1造模健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,体重200±20g。经过Morris水迷宫试验筛选,合格者进行模型制备。筛选后获得合格动物57只,按照随机分组的方法将大鼠分为对照组(n=20)和实验组(n=30)。对照组又分游泳对照组(A组n=10)和非游泳对照组(E组n=10);实验组又分为PTZ组(B组n=10)、PTZ+脑力隆组(C组n=10)、PTZ+LTG组(D组n=10)。造模过程中大鼠出现死亡或不符合模型要求者,予以剔除并随机补充,以保证每组动物10只。1.1慢性癫痫动物模型的建立实验组大鼠每日腹腔注射1%PTZ 35mg/kg一次,对照组每日腹腔注射等量的NS。大约15天后,依据Racine分级标准对动物逐个进行观察记录,凡已获得连续3次Ⅱ级或Ⅲ级以上发作者,被认为完全点燃。1.2灌胃处理动物完全点燃后,进行灌胃处理。A组、B组、E组大鼠分别灌NS 1ml/次,C组灌脑力隆1/4粒/次,D组灌LTG20mg/kg/次。每日灌胃两次,大约灌胃20日左右。2脑电图动物完全点然后,每组随机选取大鼠2-3只,麻醉后固定于脑立体定向仪上,放置额叶皮质和颞叶皮质电极,待大鼠清醒后,腹腔注射PTZ致大鼠痫性发作,并描记脑电图,验证点燃效果。3认知功能检测造模成功后,通过Morris水迷宫试验检测A, B, C, D组大鼠的认知功能,以寻找平台潜伏期(Searching platform latency, SPL)、寻找平台时间(Searching platform time)和逗留平台象限时间(Stay time)作为大鼠的学习记忆成绩。4免疫组织化学染色麻醉状态下经左心室行主动脉插管,4%多聚甲醛溶液进行灌注,取脑固定,常规包埋,标本冠状位石蜡切片。经抗原修复、羊血清封闭后,加nNOS多克隆抗体,在经二抗、三抗孵育,DAB显色后置显微镜下观察记录。结果1癫痫行为学各实验组大鼠均出现了不同程度的痫性发作,在进行灌胃处理后,D组大鼠的痫性发作明显减少,而B组和C组大鼠的痫性发作未见减少,造模成功。2脑电图对照组大鼠脑电图以α波为主,散在θ波,双侧对称,无痫样放电;慢性癫痫模型大鼠脑电图描记显示在低幅的背景节律下出现典型的高波幅棘-慢波、尖-慢波、棘波、尖波发放。3认知功能检测3.1各组每次寻找平台潜伏期(SPL)的比较3.1.1组内SPL的两两比较A组:第3、4、5、6次与第1次之间有显著性差异(P<0.01);第3、4、5、6次与第2次之间有显著性差异(P<0.05)。B组:第2、3、4、5、6次与第1次之间有显著性差异(P<0.01)。C组:第3、4、5、6次与第1次之间有显著性差异(P<0.01)。D组:第2次与第1次之间有显著性差异(P<0.05);第3、4、5、6次与第1次之间有显著性差异(P<0.01)。各组内其余各次SPL相比无显著性差异(P>0.05)。3.1.2组间SPL的两两比较C组、D组第6次SPL与B组SPL之间差异有显著性(P<0.05);其余各组间SPL相比无显著性差异(P>0.05)。3.2各组每天寻找平台潜伏期(SPL)的比较3.2.1组内SPL的两两比较A组:第1天与第3、4天之间有显著性差异(P<0.01);第2天与第3、4天之间有显著性差异(P<0.01)。B组:第2天与第1天之间有显著性差异(P<0.05);第4天与第3天之间有显著性差异(P<0.01);第3、4天与第2天之间有显著性差异(P<0.05)。C组:第3、4天与第1天之间有显著性差异(P<0.01);D组:第1天与第2天之间有显著性差异(P<0.01);第2天与第3、4天之间有显著性差异(P<0.05)。各组内其余各天SPL相比无显著性差异(P>0.05)。3.2.2组间SPL的两两比较第1、2、3天实验组SPL与对照组之间有显著性差异(P>0.05);第4天,C组与B组之间有显著性差异(P<0.05);第4天B组SPL与D组比较,差异无显著性(P>0.05)。3.3各组寻找平台时间和逗留平台象限时间的比较A组寻找平台时间与B、C、D组之间无显著性差异(P>0.05); C、D组逗留平台象限时间较B组明显延长,差异有显著性(P<0.05);A、C、D组逗留平台象限时间比较,差异无显著性(P>0.05)。4免疫组织化学染色大鼠海马组织nNOS阳性神经元,胞浆呈黄褐色,胞膜轮廓清楚,胞核不着色或成空泡状。nNOS免疫阳性产物在E,A,D,B,C组海马组织中的表达成依次增强趋势。结论1成功建立了拉莫三嗪治疗的癫痫大鼠模型。2癫痫可导致大鼠学习记忆功能受损;脑力隆具有促进学习记忆作用,但不能控制癫痫发作;拉莫三嗪可以很好的控制癫痫发作,对于癫痫造成的认知损害也有一定的改善作用。3生理剂量的NO对学习记忆有重要作用。4癫痫所致的学习记忆功能障碍可能与癫痫形成过程中海马组织nNOS过度表达有关;nNOS表达增多,导致内源性NO生成增多,产生神经毒性作用,损伤认知功能。5拉莫三嗪明显减少了海马组织中nNOS的表达,有利于保护正常的神经细胞功能。