目前为止,维持生物钟运行的确切分子调控过程仍然不够清楚,而且存在较大的种属差异。对分子钟系统的研究主要集中在啮齿类和鱼类的模式物种,只有少量关于两栖类和爬行类的研究。由于两栖动物是由水生到陆生进化过程中的过渡类群,其在系统发生学中占有重要位置,因此研究两栖动物能使我们更深刻地理解脊椎动物的昼夜节律系统。然而,迄今为止关于两栖类生物钟系统的基本知识还非常缺乏。因此,本研究以中华大蟾蜍为研究对象,克隆了分子钟系统的核心钟基因cDNA片段,包括正性调控元件Clock和Bmall以及负性调控元件Cry (Cry1和Cry2)和Per (Per1和Per2),探究该物种在人工授时环境下生物钟基因的节律表达与外周激素水平节律的关系。这些激素包括：(1)生物钟最重要的节律输出信号—褪黑素(MT)(2)可反映动物行为和应激状态的糖皮质激素一皮质酮(CORT)(3)能够反映机体代谢水平的甲状腺激素(T3和T4)。另外,还克隆了甲状腺激素受体β。主要实验结果如下：(1)中华大蟾蜍在12L：12D光周期条件下,神经视网膜组织的生物钟基因表达模式：蟾蜍视网膜上的Clock基因的表达呈现出明显的昼夜节律模式(SE(A)/A<0.3),虽然Bmall的表达在统计上未呈现出明显的昼夜节律模式(SE(A)/A>0.3),但其表达模式与Clock类似,两者峰值出现在ZT4; Perl的表达呈现出显著的24h昼夜节律(SE(A)/A<0.3),其波峰值出现在黑暗期ZT20,而Per2基因的表达的节律性在统计上并不显著(SE(A)/A>0.3),且与Perl表现出相反的昼夜反应模式；Cry1和Cry2基因的表达模式均未呈现出显著的节律性(SE(A)/A>0.3),两者在黑暗期表达水平要略高于光照期,在趋势上似乎具有一定的同步性。(2)中华大蟾蜍在12L：12D光周期条件下,脑组织的生物钟基因表达模式：蟾蜍脑组织内Clock和Bmall的表达均具有明显的昼夜节律(SE(A)/A<0.3),两者在光照启动后4h(ZT4)同时达到峰值(P<0.05),在黑暗期ZT16同时降至谷值(P<0.05); Perl和Per2表达均呈现出显著的昼夜节律(SE(A)/A<0.3), Cryl表达也具有明显的昼夜节律(SE(A)/A<0.3),但Cry2表达在统计上没有明显的昼夜节律(SE(A)/A<0.3),脑组织内Cry1与Per1、Cry2与Per2的表达呈现出明确的趋同性。(3)中华大蟾蜍血浆中激素水平的昼夜节律变化：蟾蜍血浆中MT存在一个明显的24h昼夜节律(SE(A)/A<0.3),在黑暗前夕(ZT12)时达到峰值(P<0.05),在临近光照前(ZT24)降至谷值(P<0.05)；大蟾蜍血浆皮质酮水平呈现出明显的昼夜节律模式(SE(A)/A<0.3),当光启动后第4h(ZT4)血浆皮质酮水平达到峰值(P<0.05),然后在光照结束前后显著降低(P<0.05),随后在黑暗期呈现逐渐升高的趋势(P>0.05)；蟾蜍神经视网膜和脑组织内THRβ基因mRNA表达在统计上均未呈现出显著的节律性(SE(A)/A>0.3),但是神经视网膜内THRβ表达峰值出现在ZT4,且显著高于ZT0、ZT8、ZT12、ZT20、ZT24(P<0.05),在ZT12时降至峰谷；蟾蜍血浆中T3和T4水平的昼夜节律并不明显(SE(A)/A>0.3)。通过这些研究,我们可以了解中华大蟾蜍生物钟基因表达及外周激素水平的昼夜节律模式,并能够认识生物钟对其行为和代谢的调控机制与作用规律,从而加深对两栖类生物钟系统了解。